KSHV感染细胞中特定基因产物的定量原位荧光杂交（FISH）和免疫荧光（IF）

该协议有助于在宿主细胞的上下文中，特别是与疱疹病毒相关的病毒环境中，获得对病毒基因产品的时间调控的定量洞察。这种技术可以帮助解决与宿主和病毒RNA和蛋白质相关的研究问题。此外，该技术与同步生化测定相容。

为了将细胞粘附在8个腔室的幻灯片上，将200个固有细胞悬浮液涂抹到无菌的8室滑轨的每个腔室，并允许种子在37摄氏度和5%的二氧化碳下生长12-24小时。在孵育结束时，吸上经细胞和未连接的细胞，并立即在冰上PBS中用预冷却4%甲醛固定细胞30分钟。在固定结束时，用三、五分钟的洗涤用200微升洗涤细胞，每次洗涤温度为4摄氏度的PBS。

上次洗涤后，将固定细胞渗透200微升，每井PBS中预冷却0.5%Triton-X，在冰上10分钟。在渗透结束时，小心地取出腔室，而不会裂开幻灯片，然后用预冷的 PBS 冲洗细胞。在4摄氏度下用PBS中预冷却4%BSA的冲洗细胞，在4摄氏度下用适当的多克隆原抗体在PBS中孵育1小时，在4摄氏度。

在孵育结束时，用新鲜的PBS清洗细胞三次，用适当的二级抗体孵育细胞，与与鱼检测抗体相容的荧光在4摄氏度下孵育一小时。在演示的三次 PBS 洗涤后，在 PBS 中再次将样品修复为 4%甲醛 10-15 分钟，然后进行第二次渗透。如所证明的。然后用铝箔盖住幻灯片，以保留荧光信号并防止光漂白。

在应用45微升杂交溶液之前，用2x盐水柠檬酸钠清洗细胞。在加湿室37摄氏度下一小时后，将蒸馏水加入感兴趣的反义寡核苷酸，使变性量达到10微升。将寡核苷酸在 95 摄氏度下变性 5 分钟，然后每张幻灯片添加 35 微升新鲜杂交溶液。

然后在37摄氏度的加湿室中孵育样品10-24小时，用铝箔保护。第二天，用两个，10分钟洗细胞。2X 盐水柠檬酸钠在室温下清洗，随后在 25 摄氏度下用 1X 盐水柠檬酸钠洗涤 10 分钟。

上次洗涤后，在PBS中用预冷藏4%甲醛固定细胞，在冰上10-15分钟，然后用新鲜PBS进行三次清洗。接下来，如所证明的，渗透样品，然后用抗二恶英FTC孵育，在PBS中预冷却0.1%BSA，在4摄氏度下孵育1小时。在孵育结束时，用新鲜 PBX 洗涤幻灯片三次，并在 PBS 中用预冷却的 4% 半甲醛固定样品，在 4 摄氏度下 10-15 分钟。

在 PBS 中洗三次后，在 PBS 中用每毫升 DAPI 标记 0.4 微克，并在 PBS 中预冷却 0.5%Triton-X 15 分钟，随后在 PBS 中进行三次最终洗涤。安装带荧光珠的幻灯片，作为实验相关且适当的安装介质。用无菌湿巾去除多余的安装介质后，用多层透明指甲油将一个盖玻片密封到每个幻灯片上，并使用荧光显微镜确认实验成功执行。

然后，图像可以拍摄到共合显微镜上，在安装后一小时到一周内采集样品的图像，放大倍数为 630 倍。这些具有代表性的 FISH 和免疫荧光结果具有半量化性，有助于深入了解寡核苷酸的定位，而不是比较不同荧光染色的强度，因为这些实验在幻灯片制备中不包括荧光珠。在这些实验中，细胞质和核区域及其比例对于潜伏和细胞解KSHV感染细胞是不同的。

如图所示，面积控制在核质比中。当KSHV DNA复制在裂解阶段受到抑制时，KSHV寡核苷酸转录的早期裂解蛋白转向以细胞质为主的定位。然而，KSHV多面体RNA，尽管抑制了病毒DNA复制，却对特定核位点进行局部化。

从幻灯片中去除腔室时，注意工具上粘剂残留物很少，并使用乙醇对细胞进行渗透并削弱粘合剂。生物化学测定，如QPCR，西印，高通量测序，可以同时执行，以增加从显微图收集的定量数据。