ستكون هذه الطريقة أساسية لفهم المعدة على طول التكوين في الثدييات. من خلال السماح بإجراء التجارب على الأجنة الحية خلال المراحل الجنينية التي كانت مخبأة منذ فترة طويلة داخل رحم الأم. يسمح ، ويستمر في النمو الفعال والمناسب لأجنة الفئران خارج الرحم لفترة طويلة تصل إلى 6 أيام.
يعد تشريح الجنين السريع والكافي والمعالجة الأولية لتركيز الغاز وضغطه من أهم الخطوات لنمو الجنين بنجاح. لبدء زراعة أجنة الفئران التي يبلغ عمرها 7.5 يوم أو أكثر تقدما ، قم بتشغيل الدوار ووحدة التسخين لنظام حاضنة زراعة الأسطوانة لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل تشريح الجنين. أيضا ، أضف ماء الأوتوكلاف إلى زجاجة مدخل الغاز وأنبوب اختبار المخرج.
بعد ذلك ، قم بتشغيل وحدة تنظيم الغاز عن طريق الضغط على المفتاح الرئيسي ، ثم استخدم وحدات التحكم المعنية لضبط قيم الأكسجين وثاني أكسيد الكربون على 5٪ افتح منظم الغاز وحرك مفتاح الجهد في جهاز إرسال الضغط لضبط ضغط الغاز على حوالي 6.5 إلى 7 أرطال لكل بوصة مربعة. تأكد من قيمة ضغط الغاز باستخدام مقياس ضغط رقمي. راقب تدفق الغاز عن طريق التحقق من معدل الفقاعات التي تم إنشاؤها داخل أنبوب الاختبار المملوء بالماء المخصص داخل الحاضنة الدقيقة.
اضبط معدل الفقاعة المناسب عن طريق إغلاق أو فتح صمام تدفق الغاز على غطاء زجاجة المياه. تأكد من أن تدفق الغاز يسمح بتكوين فقاعات بمعدل 2 إلى 4 فقاعات في الثانية أو اضبط تدفق الفقاعة عند النقطة الأولى حيث تخرج الفقاعات إلى أنبوب المخرج المملوء بالماء. بعد ذلك ، املأ زجاجات الثقافة ب 2 ملليلتر من وسط الثقافة.
استخدم بنجات السيليكون المجوفة لإغلاق الزجاجات وتوصيلها بالأسطوانة الدوارة المجوفة للتوازن المسبق لمدة 1 ساعة. حافظ على المساحات الفارغة في الأسطوانة الدوارة مغلقة باستخدام الكتل الصلبة. بعد ذلك ، تشريح الأجنة من أنثى أنثى قاتلة تم قتلها.
نظف البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول وقطع الجلد وجدار البطن باستخدام المقص. حدد أحد طرفي الرحم وقطعه عند التقاطع بين المبيض والرحم. استمر في القطع على طول الرحم حتى الطرف الآخر وانقله إلى طبق بتري 100 ملم مملوء ب DPBS.
اغسل المفاهيم بسرعة في DPBS وقطعها إلى أزواج لتسهيل التعامل مع الأجنة. انقل جميع أزواج المفاهيم إلى وسط تشريح متوازن مسبقا في طبق بتري 60 ملم ، ثم قطعه إلى المفاهيم الفرديةالاستخدامات. بعد ذلك ، باستخدام زوج من الملقط الإجمالي ، قم بإزالة جدار الرحم من المفهوميستخدم عن طريق تمزيق أنسجة الرحم ، ثم باستخدام ملقط دقيق ، مجهري ، قطع طرف decidua على شكل كمثرى.
أدخل الملقط بجوار الجنين موازيا لمحوره الطويل وافتح الملقط لتقسيم الديسيدوا إلى نصفين. أخيرا ، باستخدام ملقط ناعم ، أمسك الجنين من الديسيدوا وقشر كيس الصفار الجداري من الجنين ، تاركا المخروط الخارجي المشيمي السليم متصلا بأسطوانة البيض. حدد الأجنة في الصفيحة العصبية، أو مرحلة طي الرأس المبكرة، التي لا تظهر أي ضرر في الأرومة العصبية.
انقل 5 إلى 6 أجنة مختارة لكل زجاجة إلى زجاجات الاستزراع الزجاجية المتوازنة مسبقا وضع الزجاجات في نظام الاستزراع الدوار عند 37 درجة مئوية ، في جو من 5٪ من الأكسجين و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. لزراعة أجنة ما قبل المعدة والمعدة المبكرة والصفائح الثابتة، أضف 250 ميكرولتر من وسط زراعة الأجنة خارج الرحم المعد حديثا إلى كل بئر من 8 صفيحات بئر. ضع الألواح داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية للتوازن المسبق.
بعد تشريح الأجنة خارج الرحم كما هو موضح سابقا ، قم بنقل الأجنة الفردية إلى كل بئر من صفيحة البئر 8 باستخدام ماصة صغيرة ووضع الصفيحة داخل الحاضنة مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. صور الأجنة تحت مجهر ستيريو واختر للزراعة فقط تلك التي لديها تجويف أمنيوسي جيد التكوين دون أي ضرر واضح وبدون غشاء رايشرت. تدعم ظروف زراعة الأسطوانة الموصوفة في هذا البروتوكول للأجنة البالغة من العمر 7.5 يوم نمو الجنين المستمر والطبيعي بمتوسط كفاءة يقترب من 75٪ بعد 4 أيام من الزرع.
تختلف كفاءة تطور الجنين عبر الخلفيات الوراثية المتنوعة للفئران ولكنها قوية باستمرار. المكملات الغذائية مع HBS بدلا من HCS تعطي كفاءة تبلغ حوالي 68٪ بعد 4 أيام من الثقافة. يتم تلخيص تطور 6.5 أجنة وألواح ثابتة بشكل صحيح بكفاءة تزيد عن 90٪ باستخدام وسط زراعة الأجنة خارج الرحم مع كل من HCS و HBS.
تظهر الثقافات التي تبدأ من الأجنة قبل المعدة كفاءة بنسبة 46٪ من التطور السليم إلى مرحلة السوميت المبكرة وما يقرب من 17٪ من الأجنة تكمل التطور السليم بعد 6 أيام من الزرع. يستمر التشكل وتطور الأنسجة بشكل صحيح حتى 42 سوميت. تظهر هنا العيوب التنموية التمثيلية التي لوحظت في الأجنة للمزارع التي بدأت من اليوم الجنيني 7.5 و 6.5 و 5.5.
يجب التخلص من الأجنة ذات الأضرار الطفيفة في الأرومة أو الأجنة التي تحتفظ بغشاء رايشرت. لن تنمو الأجنة المبكرة بشكل صحيح أو تظهر تأخيرات شديدة في النمو في حين أن ربط الأرومة الجنينية بسطح الصفيحة سيؤدي إلى فشل المزيد من تطور الجنين. التشوهات الرئيسية التي لوحظت في الأجنة المعيبة هي تطور المنطقة الخلفية خارج كيس الصفار أو عيوب في نمو الطيات العصبية.
في الثقافات المطورة من الأجنة البالغة من العمر 5.5 يوم ، غالبا ما يلاحظ عيب النمو هو وجود أبلوبلاست صغير متخلف. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن للباحثين إجراء مجموعة متنوعة من التلاعب الفيزيائي أو الكيميائي في تطوير الأجنة بعد الزرع. على سبيل المثال ، التلاعب أو زرع الخلايا أو تتبع الأنساب.
هذه الطريقة لا تمهد الطريق فقط لدراسة الفئران بعد الزرع النامية بتفصيل كبير ، ولكن أيضا لتنفيذ طرق استزراع مماثلة في الأجنة من الأنواع الأخرى ، مثل الإنسان.
