Este método será fundamental para a compreensão da gastrulação ao longo de uma formação em mamíferos. Permitindo experimentação em embriões vivos durante estágios embrionários que há muito tempo estão escondidos dentro do útero materno. Permite, continua o crescimento eficiente e adequado de embriões de camundongos fora do útero por um período prolongado de até 6 dias.
Dissecção rápida e adequada de embriões e pregastrulação da concentração e pressão do gás são os passos mais críticos para o crescimento bem sucedido do embrião. Para começar a cultivar embriões de camundongos de 7,5 dias ou mais avançados, ligue o rotador e a unidade de aquecimento do sistema de incubadora de cultura de rolo por pelo menos 1 hora antes das dissecções do embrião. Além disso, adicione água autoclave ao frasco de entrada de gás e ao tubo de ensaio de saída.
Em seguida, ligue o módulo regulador de gás pressionando o interruptor principal, em seguida, use os respectivos controladores para definir os valores de oxigênio e dióxido de carbono para 5% Abra o regulador de gás e mova o interruptor de tensão no transmissor de pressão para definir a pressão do gás para aproximadamente 6,5 a 7 libras por polegada quadrada. Confirme o valor da pressão do gás usando um medidor de pressão digital. Monitore o fluxo de gás verificando a taxa de bolhas criadas dentro do tubo de ensaio cheio de água de saída alocado dentro da incubadora de precisão.
Defina a taxa de bolha adequada fechando ou abrindo a válvula de fluxo de gás na tampa da garrafa de água. Certifique-se de que o fluxo de gás permite a formação de bolhas a uma taxa de 2 a 4 bolhas por segundo ou definir o fluxo de bolhas no primeiro ponto onde borbulhar sai para o tubo de saída cheio de água. Em seguida, encha as garrafas de cultura com 2 mililitros de meio de cultura.
Use os bungs de silício oco para selar as garrafas e conectá-las ao tambor giratório oco para pré-equilíbrio por 1 hora. Mantenha os espaços vazios no tambor rotativo selado usando os bungs sólidos. Em seguida, dissecar os embriões de um rato fêmea grávida eutanizado.
Limpe o abdômen com 70% de etanol e corte a pele e a parede abdominal usando uma tesoura. Localize uma extremidade do útero e corte na intersecção entre o ovário e o útero. Continue cortando ao longo do útero até a outra extremidade e transfira para uma placa de Petri de 100 milímetros cheia de DPBS.
Lave rapidamente os conceitos em DPBS e corte em pares para facilitar o manuseio de embriões. Mova todos os pares de conceitos para o meio de dissecção pré-equilibrado em uma placa de Petri de 60 milímetros, em seguida, corte nos conceitos individuais. Em seguida, usando um par de fórceps brutos, remova a parede uterina dos conceitos rasgando o tecido uterino, em seguida, usando fórceps finos e microcirúrgicos, corte a ponta da decidua em forma de pera.
Insira as fórceps ao lado do embrião paralela ao seu longo eixo e abra os fórceps para dividir o decidua em metades. Finalmente, usando fórceps finos, segure o embrião da decidua e retire o saco de gema parietal do embrião, deixando o cone ectoplacental intacto preso ao cilindro de ovo. Selecione os embriões na placa neural, ou estágio de dobra da cabeça, que não mostram nenhum dano no epiblasto.
Transfira de 5 a 6 embriões selecionados por garrafa para as garrafas de cultura de vidro pré-equilibradas e coloque as garrafas no sistema de cultura rotativa a 37 graus Celsius, em uma atmosfera de 5% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. À cultura pré-estresculação e embriões gastruladores precoces e placas estáticas, adicione 250 microliters de cultura de ex-embrião ex-útero recém-preparada para cada poço de uma placa de poço de 8 poços. Coloque as placas dentro de uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius para pré-equilíbrio.
Após dissecar os embriões do útero como demonstrado anteriormente, transfira os embriões individuais para cada poço da placa de 8 poços usando uma micro pipeta e coloque a placa dentro da incubadora com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Imagem os embriões sob um microscópio estéreo e selecione para a cultura apenas aqueles com uma cavidade amniótica bem formada sem danos evidentes e sem a membrana do Reichert. As condições de cultura do rolo descritas neste protocolo para embriões de 7,5 dias de idade suportam o crescimento constante e normal do embrião com uma eficiência média próxima de 75% após 4 dias de cultura.
A eficiência do desenvolvimento de embriões varia entre diversos antecedentes genéticos de camundongos, mas é consistentemente robusta. A suplementação com HBS em vez de HCS produz uma eficiência de aproximadamente 68% após 4 dias de cultura. O desenvolvimento de 6,5 embriões e placas estáticas é corretamente recapitulado com uma eficiência de mais de 90% utilizando meio de cultura de ex-embrião utero com HCS e HBS.
Culturas a partir da pré-strulação de embriões mostram uma eficiência de 46% do desenvolvimento adequado para o estágio somite precoce e quase 17% dos embriões completam o desenvolvimento adequado após 6 dias de cultura. A morfogênese e o desenvolvimento de tecidos prosseguem adequadamente até 42 somites. São mostrados os defeitos representativos de desenvolvimento observados em embriões para culturas iniciadas a partir do dia embrionário 7.5, 6.5 e 5.5.
Embriões com pequenos danos ao epiblasto ou embriões que retenham a membrana do Reichert devem ser descartados. Os embriões precoces não crescerão adequadamente ou apresentarão graves atrasos no desenvolvimento, enquanto a fixação do epiblasto embrionário à superfície da placa causará a falha do desenvolvimento de embriões. As principais anormalidades observadas em embriões defeituosos são o desenvolvimento da região posterior fora do saco de gema ou defeitos no crescimento das dobras neurais.
Em culturas desenvolvidas a partir de embriões de 5,5 dias de idade são frequentemente observados defeito de desenvolvimento é a presença de um pequeno epiblasto subdesenvolvido. Usando este método, os pesquisadores são capazes de realizar uma variedade de manipulações físicas ou químicas no desenvolvimento de embriões pós-implantados. Por exemplo, manipulação, transplante celular ou rastreamento de linhagem.
Este método não só abre caminho para o estudo do pós-implantação do camundongo em grande detalhe, mas também para a implementação de métodos de cultura semelhantes em embriões de outras espécies, como o humano.
