We thank Kwon laboratory members for helpful discussions. This work was supported by grants from NHLBI/NIH (R01HL111198) and Maryland Stem Cell Research Fund (MSCRF).

واستمرت كل الفئران في والجمعية الأمريكية لاعتماد المختبرات رعاية الحيوان (AAALAC) -accredited منشأة الحيوان في جامعة جونز هوبكنز ويضم وفقا للإجراءات المنصوص عليها في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. وافقت لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC) جميع البروتوكولات التجريبية. 1. إعداد التجريبية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف لوحة 12-جيدا مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) في الفوسفات مخزنة الحل (PBS) لمدة 60 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حل طلاء وإضافة 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام الحرة المصل (SFM). برم لوحة للتأكد من أن الفيلم من وسائل الاعلام يغطي مساحة بأكملها. </li></ol> 2. العمليات الجراحية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفئران الحوامل باستخدام بروتوكول رعاية الحيوان وافقت عليها لجنة المؤسسة تليها خلع عنق الرحم للتأكد من القتل الرحيم كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رش وتنظيف المنطقة بطن الفأر مع 70٪الإيثانول. الحفاظ على تقنيات معقمة صارمة لتجنب التلوث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط ومقص لتقديم 0.5 سم 2 شق في منطقة السرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الأصابع لقرصة / انتزاع الجلد فوق وتحت شق وسحب بلطف الجلد في اتجاهين متعاكسين (الرأس والذيل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط ومقص لإجراء شق الأولي في الغشاء في منطقة السرة. خفض بلطف الغشاء في V-شكل من السرة إلى المبيضين على كل جانب (2 × 1.5 سم 2)، وبالتالي الكشف عن الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لقرصة قناة البيض ربط الرحم إلى المبيض ومقص لقرصة قناة البيض على الجانب المبيض، وبالتالي تحرير الرحم من المبيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب بلطف صعودا الرحم بواسطة قناة البيض مع ملقط وقطع الرحم خال من منطقة المثانة مع مقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الرحم زيادة بنسبة قناة البيض مع ملقط، وقطع قناة البيض مع مقص على الجانب الآخر، وبالتالي الإفراج عن الرحم من م[أوس]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الرحم إلى أنبوب 50 مل وإضافة 20 مل من برنامج تلفزيوني الباردة عقيمة مع الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+. PBS يجب أن يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ خلال تشريح الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يهز بلطف الأنبوب لمدة 10 ثانية لغسل الرحم للدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الرحم من الأنبوب مع ملقط ووضعه في طبق 10 مل وإضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني الباردة على الجزء العلوي من الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الطبق مع الرحم تحت stereomicroscope. ملاحظة: الخطوات 2،13-2،19 يتطلب stereomicroscope. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام اثنين من أزواج من ملقط لفتح بلطف الرحم وتشريح خارج الحويصلات السلوي مع الأجنة من الرحم واحدا تلو الآخر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام اثنين من أزواج من ملقط لفتح بعناية الكيس الأمنيوسي الذي يحيط الجنين، قرصة الكيس مع واحد ملقط وبلطف إزالته من الجنين، استخدام الملقط أخرى لخفض والافراج عن الكيس الذي يحيط بالجنين من الجنين. إذا كان النمط الجيني المحددة اللازمة، والحفاظ على الكيس السلوي لالتنميط الجيني. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجنين على الجانب واستخدام ملقط لقطع شارع 1 و 2 الثانية قوس خلفي للقلب بين القوس والحقيبة البلعوم (الشكل 1A &#39;&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوجه بلطف الجنين إلى الجانب الآخر واستخدام ملقط لقطع 1 و 2 قوس خلفي للقلب بين القوس والحقيبة البلعوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لقطع المسالك تدفق القلب الذي لا يزال يربط بين شارع 1 و 2 الثانية البلعوم الأقواس إلى الجنين. إزالة الأقواس، والتي لا تزال تعلق معا في شكل فراشة (الشكل 1B)، من الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لقرصة والافراج عن 1 أقواس الحادي والبلعوم مما تبقى من القلب المسالك تدفق والمعى الأمامي الأديم الباطن (الشكل 1B &#39;&#39; وأشار مع خط متقطع و*). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لقرصة والافراج عن الأقواس 2 الثانية البلعوم مما تبقى من القلب تدفق المجاريوالمعى الأمامي الأديم الباطن (الشكل 1B &#39;&#39; وأشار مع خط متقطع و**). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كل زوج من الأقواس بشكل منفصل باستخدام ملقط ووضع حد سواء الأقواس في منتصف المعين جيدا. لوحة 1 و 2 ش الثانية البلعوم الأقواس في آبار منفصلة. تأكد من أن الأقواس على اتصال مع الفيلم وسائل الإعلام المضافة في الخطوة 1.2. ومن الأهمية بمكان أن الأقواس غير مشمولة المتوسطة، لأنها تحتاج إلى إجراء اتصالات مع سطح البئر لمرفق خلال هذه الفترة. </li></ol> 3. الحضانة والتصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأقواس مطلي في 12 لوحة جيدا في 37 ° C / 5 CO 2٪ لمدة 2 ساعة لالأقواس لنعلق على منطقة السطح جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف إضافة 200 ميكرولتر من 37 درجة مئوية SFM أسفل الجانب من البئر. تأكد من أن الأقواس لا تزال تعلق واحتضان O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم التالي، والتحقق بصريا أن الأقواس البلعومية وترد وتضيف بلطف 200 ميكرولتر من 37 درجة مئوية SFM أسفل الجانب منحسنا. إذا ظلت الأقواس غير مرتبط والعائمة، وإزالة بلطف وسائل الاعلام مع ماصة دون إزالة الأقواس حتى يتم ترك الفيلم من وسائل الإعلام فقط. استخدام ماصة لوضع الأقواس في منتصف البئر وكرر الخطوة 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة يوميا؛ إضافة ~ 100-200 ميكرولتر من وسائل الإعلام كل يوم 2 لاستبدال أي وسائط تبخرت. ملاحظة: 24-48 ساعة بعد الخلايا المهاجرة تظهر حول قوس وسوف تتكاثر وتهاجر من قوس خلال الأيام المقبلة 5-8. بعد 36-72 ساعة من تشكيل العضلية الضرب ويمكن ملاحظة من 2 الثانية البلعوم القوس (الشكل 2B). ويمكن ملاحظة تكوين myotube مركزيا من 1 الحادي والبلعوم اللدود 3-7 أيام بعد التعلق (الشكل 2A). </li></ol>

<ol>
	<li>Kelly, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+heart+field.">The second heart field.</a> Curr Top Dev Biol. 100, 33-65 (2012).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+congenital+heart+disease.">The developmental genetics of congenital heart disease.</a> Nature. 451, 943-948 (2008).</li><li>Tzahor, E., Evans, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharyngeal+mesoderm+development+during+embryogenesis:+implications+for+both+heart+and+head+myogenesis.">Pharyngeal mesoderm development during embryogenesis: implications for both heart and head myogenesis.</a> Cardiovasc Res. 91, 196-202 (2011).</li><li>Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Contact+with+Endoderm-like+Cells+Efficiently+Induces+Cardiac+Progenitors+from+Mouse+and+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Direct Contact with Endoderm-like Cells Efficiently Induces Cardiac Progenitors from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells.</a> PLoS One. 7 (10), e46413 (2012).</li><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+mesendodermal+cell+fate+decisions.">Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions.</a> Development. 140, 2587-2596 (2013).</li><li>Kwon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+pathway+involving+Notch1/beta-catenin/Isl1+determines+cardiac+progenitor+cell+fate.">A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate.</a> Nature cell biology. 11, 951-957 (2009).</li><li>Shenje, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+deletion+of+Numb+and+Numblike+reveals+renewal+of+cardiac+progenitors.">Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors.</a> Elife. 3, e02164 (2014).</li><li>Grevellec, A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharyngeal+pouches+and+clefts:+Development,+evolution,+structure+and+derivatives.">The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives.</a> Semin Cell Dev Biol. 21, 325-332 (2010).</li><li>Kwon, C., Cordes, K. R., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+acts+at+multiple+developmental+stages+to+promote+mammalian+cardiogenesis.">Wnt/beta-catenin signaling acts at multiple developmental stages to promote mammalian cardiogenesis.</a> Cell Cycle. 7, 3815-3818 (2008).</li><li>Cho, G. S., Fernandez, L., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+for+the+heart:+perspectives+on+stem-cell+therapy.">Regenerative medicine for the heart: perspectives on stem-cell therapy.</a> Antioxid Redox Signal. 21, 2018-2031 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

في هذا الفيديو، ونحن لشرح كيفية عزل والثقافة أولا والبلعوم الثاني أقواس 9.5 أيام أجنة الفئران القديمة. وعابرة، مجزأة الأقواس البلعومية الانتفاخات التي تظهر على الجانب craniolateral الأجنة النامية 9، والتي تحتوي على كتل بناء الخلايا الاصلية قلبية متعددة فعالة لجعل ال?...

خلايا الأديم المتوسط ​​البلعوم تؤدي إلى أجزاء من القلب وعضلات البلعوم. أثناء التطور الجنيني، الخلايا الاصلية القلب متعددة القدرات من الميدان قلبية ثانية تهاجر من الأديم المتوسط ​​البلعوم وتعبئة المسالك تدفق القلب والبطين الأيمن، ويرتبط ارتباطا وثيقا تنميتها غير طبيعية مع مرض القلب الخلقي السبب الرئيسي للالعيوب الخلقية وdefect- الولادة الوفيات المرتبطة في البشر 1-3. وقد أثبتت الدراسات الحديثة أن البلعوم الأديم المتوسط ​​يساهم في رأس العضلات، بالإضافة إلى القلب، مما يجعل من الأديم المتوسط ​​جزء هام من التنمية القلب القحفي 4. وبالتالي، فإن العمليات التنموية بما في ذلك الاستقراء، والانتشار، والتفريق بين الرأس والقلب الأسلاف في الأديم المتوسط ​​البلعوم هي قيد التحقيق النشط 5-7. حتى وقت قريب، فإنه لا يزال غير معروف ما إذا كانت الخلايا الاصلية القلب تخضع witho التوسعالتحرير التمايز، ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم توافر معلومات عن بيئتهم الخلوية. تشير دراستنا الأخيرة أن الأقواس البلعومية بمثابة المكروية لتجديد الأسلاف القلب والعضلات ويمكن تربيتها خارج الجسم الحي على مدى عدة أسابيع 8. يوفر هذا الأسلوب يزدرع فرصة جديدة وفريدة من نوعها لدراسة تطوير الأسلاف القلب والقحفي خارج الحي.

<table><tbody><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>PBS + Ca&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; + Mg&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Petri plates</td><td>Fishersci</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Scissor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serum Free Media:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Cellgro</td><td>15-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ham&amp;rsquo;s F12</td><td>Cellgro</td><td>10-080-CV</td><td></td></tr><tr><td>N2-SUPPLEMENT</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27-retinoic acid</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>10% BSA (in PBS) (Invitrogen Cat#. P2489)</td><td>Life Sciences</td><td>P2489</td><td></td></tr><tr><td>100x Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081)</td><td>Gibco</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>100x Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo culture of pharyngeal arches to study heart and muscle progenitors and their niche

الأديم المتوسط ​​البلعوم الأجنة النامية يساهم في مناطق واسعة من الرأس وعضلات القلب. قمنا بتطوير طريقة جديدة لدراسة الرأس والسلف القلب تنمية الخلايا مع الأقواس البلعومية (المعروف أيضا باسم الأقواس خيشومي) خارج الحي. باستخدام هذه الطريقة، التي وصفناها في الآونة الأخيرة أن القوس البلعومية الثاني يحتوي الأسلاف القلب تجديد الذات وبمثابة المكروية لتوسيع الأسلاف خلال تطوير الماوس القلب. تبقى الخلايا الاصلية غير متمايزة واسعة داخل القوس، ولكن سرعان ما تصبح العضلية وظيفية تهاجر خارج القوس. ذكرنا أيضا أن أول القوس البلعومية يحتوي الأسلاف العضلات مما أدى إلى myotubes بعد خروجه من القوس. هنا، علينا أن نظهر إجراء تشريح الجسم الحي وخارج ثقافة الأولى والثانية الأقواس البلعومية من تطوير أجنة الفئران. طريقة تمكن واحد لدراسة الرأس والقلب السلف / ديف العضلاتelopment، بما في ذلك cardiomyocyte وتشكيل myotube مركزيا في التفاصيل خارج الحي.

خلال التنمية، الوجه العضلات والقلب الأسلاف يمكن أن تعزى لأنها تتكاثر وتهاجر من شارع 1 و 2 الثانية البلعوم القوس، ليصبح الرأس وعضلات القلب، على التوالي (الشكل 1A، A &#39;و&#39; &#39;). زراعة الأقواس البلعومية يوفر وسيلة فريدة لدراسة القلب والعضلات التنمية ...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche at JoVE.com

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

فيفو السابقين الثقافة من بلعومي الأقواس لدراسة القلب والعضلات الأسلاف ومكانها المناسب

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

ex-vivo-culture-pharyngeal-arches-to-study-heart-muscle-progenitors

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

7.8K Views.  Johns Hopkins University School of Medicine. Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Video: Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, and allow for the study of the cellular and molecular basis of normal and abnormal cardiac morphogenesis. Recent emerging technologies of retrospective single clonal analyses make the study of cardiac morphogenesis at single cell resolution feasible. However, tissue opacity and light scattering of the heart as imaging depth is increased hinder whole-heart imaging at single cell resolution. To overcome these obstacles, a whole-embryo clearing system that can render the heart highly transparent for both illumination and detection must be developed. Fortunately, in the last several years, many methodologies for whole-organism clearing systems such as CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB and PACT have been reported. This lab is interested in the cellular and molecular mechanisms of cardiac morphogenesis. Recently, we established single cell lineage tracing via the ROSA26-CreERT2; ROSA26-Confetti system to sparsely label cells during cardiac development. We adapted several whole embryo-clearing methodologies including Scale and CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis) to clear the embryo in combination with whole mount staining to image single clones inside the heart. The heart was successfully imaged at single cell resolution. We found that Scale can clear the embryonic heart, but cannot effectively clear the postnatal heart, while CUBIC can clear the postnatal heart, but damages the embryonic heart by dissolving the tissue. The methods described here will permit the study of gene function at a single clone resolution during cardiac morphogenesis, which, in turn, can reveal the cellular and molecular basis of congenital heart defects.

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

التصوير تطهيرها الجنينية وبعد الولادة قلوب في قرار وحيدة الخلية

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-&#946;1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.

في المختبر ثقافة خلايا النخابية من الفأر الجنينية القلب

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium ...

Engineering

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

تحليل كمي الجامع-جبل الفلورة السكان السلف القلب في الأجنة الماوس

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

النظام القائم على microinjection لفي غرس فيفو Cardiomyocytes الجنينية في جنين الطيور

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in developmental cardiology have led to generating cardiac cells from pluripotent stem cells, it is unclear if the two cardiac fields - the first and second heart fields (FHF and SHF) &#8212; are induced in pluripotent stem cells systems. To address this, we generated a protocol for in vitro specification and isolation of heart field-specific cardiac progenitor cells. We used embryonic stem cells lines carrying Hcn4-GFP and Tbx1-Cre; Rosa-RFP reporters of the FHF and the SHF, respectively, and live cell immunostaining of the cell membrane protein Cxcr4, a SHF marker. With this approach, we generated progenitor cells which recapitulate the functional properties and transcriptome of their in vivo counterparts. Our protocol can be utilized to study early specification and segregation of the two heart fields and to generate chamber-specific cardiac cells for heart disease modelling. Since this is an in vitro organoid system, it may not provide precise anatomical information. However, this system overcomes the poor accessibility of gastrulation-stage embryos and can be upscaled for high-throughput screens.

The purpose of this method is to generate heart field-specific cardiac progenitor cells in vitro in order to study the progenitor cell specification and functional properties, and to generate chamber specific cardiac cells for heart disease modelling.

في المختبر جيل من خلايا القلب القلب حقل محدد

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart disease. To study the formation of PAAs, we developed a protocol using whole-mount immunofluorescence coupled with benzyl alcohol/benzyl benzoate (BABB) tissue clearing, and confocal microscopy. This allows for the visualization of the pharyngeal arch endothelium at a fine cellular resolution as well as the 3D connectivity of the vasculature. Using software, we have established a protocol to quantify the number of endothelial cells (ECs) in PAAs, as well as the number of ECs within the vascular plexus surrounding the PAAs within pharyngeal arches 3, 4, and 6. When applied to the whole embryo, this methodology provides a comprehensive visualization and quantitative analysis of embryonic vasculature.

Here, we describe a protocol to visualize and analyze the pharyngeal arch arteries 3, 4, and 6 of mouse embryos using whole-mount immunofluorescence, tissue clearing, confocal microscopy, and 3D reconstruction.

التصور والتحليل من الشرايين القوس البلعوم ية باستخدام كامل جبل الكيمياء المناعية وإعادة الإعمار 3D

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in vitro. Developing more efficient organ-like platforms that can model complex in vivo phenotypes, such as organoids and organs-on-a-chip, will enhance the ability to study human heart development and disease. This paper describes a protocol to generate highly complex human heart organoids (hHOs) by self-organization using human pluripotent stem cells and stepwise developmental pathway activation using small molecule inhibitors. Embryoid bodies (EBs) are generated in a 96-well plate with round-bottom, ultra-low attachment wells, facilitating suspension culture of individualized constructs.
The EBs undergo differentiation into hHOs by a three-step Wnt signaling modulation strategy, which involves an initial Wnt pathway activation to induce cardiac mesoderm fate, a second step of Wnt inhibition to create definitive cardiac lineages, and a third Wnt activation step to induce proepicardial organ tissues. These steps, carried out in a 96-well format, are highly efficient, reproducible, and produce large amounts of organoids per run. Analysis by immunofluorescence imaging from day 3 to day 11 of differentiation reveals first and second heart field specifications and highly complex tissues inside hHOs at day 15, including myocardial tissue with regions of atrial and ventricular cardiomyocytes, as well as internal chambers lined with endocardial tissue. The organoids also exhibit an intricate vascular network throughout the structure and an external lining of epicardial tissue. From a functional standpoint, hHOs beat robustly and present normal calcium activity as determined by Fluo-4 live imaging. Overall, this protocol constitutes a solid platform for in vitro studies in human organ-like cardiac tissues.

Here, we describe a protocol to create developmentally relevant human heart organoids (hHOs) efficiently using human pluripotent stem cells by self-organization. The protocol relies on the sequential activation of developmental cues and produces highly complex, functionally relevant human heart tissues.

توليد ذاتية التجميع الأعضاء القلب البشري المستمدة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in ...

Biochemistry

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

العزلة وثقافة الطيور الجنينية الخلايا الاصلية صمامي

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Biology

A Label-free Xenograft Model for Investigating the Behavior of Human Stem Cell Spheroids in Chick Embryos

Xenografts are valuable methods to investigate the behavior of human cells in vivo. In particular, the embryonic environment provides cues for cell migration, differentiation, and morphogenesis, with unique instructive signals and germ layer identity that are often absent from adult xenograft models. In addition, embryonic models cannot discriminate self versus non-self tissues, eliminating the risk of rejection of the graft and the need for immune suppression of the host. This paper presents a methodology for transplantation of spheroids of human cells into chicken embryos, which are accessible, amenable to manipulation, and develop at 37 &#176;C. 
Spheroids allow the selection of a specific region of the embryo for transplantation. After being grafted, the cells become integrated into the host tissue, allowing the follow-up of their migration, growth, and differentiation. This model is flexible enough to allow the utilization of different adherent populations, including heterogeneous primary cell populations and cancer cells. To circumvent the need for prior cell labeling, a protocol for the identification of donor cells through hybridization of human-specific Alu probes is also described, which is particularly important when investigating heterogeneous cell populations. Furthermore, DNA probes can be easily adapted to identify other donor species. This protocol will describe the general methods for preparing spheroids, grafting into chicken embryos, fixing and processing tissue for paraffin sectioning, and finally identifying the human cells using DNA in situ hybridization. Suggested controls, examples of interpretation of results and various cell behaviors that can be assayed will be discussed in addition to the limitations of this method.

<meta charset="utf8"></head><body>نموذج Xenograft خال من الملصقات للتحقيق في سلوك الخلايا الجذعية البشرية الكروية في أجنة الكتاكيت

Here, we describe a method to transplant and identify human cell spheroids into chick embryos. This xenograft model uses the embryonic microenvironment as a source of instructive signals to assay cell migration, differentiation, and tropism and is especially suited for the study of primary and/or heterogeneous cell populations.

نموذج Xenograft خال من الملصقات للتحقيق في سلوك الخلايا الجذعية البشرية الكروية في أجنة الكتاكيت

Xenografts are valuable methods to investigate the behavior of human cells in vivo. In particular, the embryonic environment provides cues for cell ...

فيفو السابقين الثقافة من بلعومي الأقواس لدراسة القلب والعضلات الأسلاف ومكانها المناسب

Summary

Explore More Videos

التصوير تطهيرها الجنينية وبعد الولادة قلوب في قرار وحيدة الخلية

في المختبر ثقافة خلايا النخابية من الفأر الجنينية القلب

تحليل كمي الجامع-جبل الفلورة السكان السلف القلب في الأجنة الماوس

النظام القائم على microinjection لفي غرس فيفو Cardiomyocytes الجنينية في جنين الطيور

في المختبر جيل من خلايا القلب القلب حقل محدد

التصور والتحليل من الشرايين القوس البلعوم ية باستخدام كامل جبل الكيمياء المناعية وإعادة الإعمار 3D

توليد ذاتية التجميع الأعضاء القلب البشري المستمدة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات

العزلة وثقافة الطيور الجنينية الخلايا الاصلية صمامي

نموذج Xenograft خال من الملصقات للتحقيق في سلوك الخلايا الجذعية البشرية الكروية في أجنة الكتاكيت

نموذج Xenograft خال من الملصقات للتحقيق في سلوك الخلايا الجذعية البشرية الكروية في أجنة الكتاكيت