前子宫 从前肠胚形成到晚期器官生成的小鼠胚胎培养

这种方法对于理解哺乳动物中形成的原肠胚形成至关重要。通过允许在长期隐藏在母体子宫内的胚胎阶段对活胚胎进行实验。它允许小鼠胚胎在子宫外持续有效和适当的生长，长达6天。

快速和充分的胚胎解剖和气体浓度和压力的预胃原析是成功胚胎生长的最关键步骤。要开始培养7.5天龄或更先进的小鼠胚胎，请在胚胎解剖前打开滚筒培养箱系统的旋转器和加热装置至少1小时。此外，将高压灭菌器水添加到进气瓶和出口试管中。

接下来，通过按下主开关打开气体调节模块，然后使用相应的控制器将氧气和二氧化碳值设置为5%打开气体调节器并移动压力变送器中的电压开关，将气体压力设置为每平方英寸约6.5至7磅。使用数字压力表确认气体压力值。通过检查在精密培养箱内分配的充满水的试管内产生的气泡速率来监测气体流量。

通过关闭或打开水瓶盖上的气流阀来设置适当的气泡速率。确保气流允许以每秒2到4个气泡的速率形成气泡，或者将气泡流量设置为气泡流出到充满水的出口管的第一个点。接下来，用2毫升培养基填充培养瓶。

使用空心硅包密封瓶子，并将其插入空心旋转滚筒中进行1小时的预平衡。使用实心滚筒将旋转滚筒中的空隙密封。接下来，从安乐死的怀孕雌性小鼠身上解剖胚胎。

用70%乙醇清洁腹部，用剪刀切开皮肤和腹壁。找到子宫的一端，并在卵巢和子宫之间的交叉处切开。继续沿着子宫切割直到另一端，然后转移到充满DPBS的100毫米培养皿中。

在DPBS中快速清洗概念，并成对切割，以方便胚胎处理。将所有概念对移动到60毫米培养皿中的预平衡解剖培养基中，然后切入单个概念。接下来，使用一对粗镊子，通过撕裂子宫组织来去除概念的子宫壁，然后使用细小的显微外科钳，切开梨形蜕膜的尖端。

将镊子插入胚胎旁边，平行于其长轴，并打开镊子将蜕膜分成两半。最后，使用细镊子，从蜕膜上抓住胚胎，将顶叶蛋黄袋从胚胎上剥离，留下完整的外蝶骨锥体附着在卵圆筒上。选择神经板或早期头部折叠阶段的胚胎，这些胚胎在外胚层中未显示损伤。

将每瓶5至6个选定的胚胎转移到预平衡的玻璃培养瓶中，并将瓶子置于37摄氏度的旋转培养系统中，在5%氧气和5%二氧化碳的气氛中。为了培养预原胚和早期原肠胚和静态板，向8孔板的每个孔中加入250微升新鲜制备的宫前胚胎培养基。将板放入37摄氏度的二氧化碳培养箱内进行预平衡。

如前所述，将胚胎从子宫中解剖出来后，使用微量移液管将单个胚胎转移到8孔板的每个孔中，并将板放入培养箱内，在37摄氏度下加入5%二氧化碳。在体视显微镜下对胚胎进行成像，并仅选择具有良好形成的羊膜腔且没有明显损伤且没有Reichert膜的胚胎进行培养。该协议中描述的7.5天大胚胎的滚筒培养条件支持恒定和正常的胚胎生长，4个培养天后的平均效率接近75%。

胚胎发育的效率因不同的小鼠遗传背景而异，但始终保持稳健。在培养 4 天后，补充 HBS 代替 HCS 可产生约 68% 的效率。使用具有HCS和HBS的宫前胚胎培养基，以超过90%的效率正确概括6.5个胚胎和静态板的发育。

从预孕胚胎开始的培养物显示出46%的正常发育效率，直到早期somite阶段，近17%的胚胎在培养6天后完成正常发育。形态发生和组织发育正常进行，直到42个索米特。此处显示了从胚胎第7.5天，6.5天和5.5日开始的培养物在胚胎中观察到的代表性发育缺陷。

对外胚层细胞有轻微损伤的胚胎或保留Reichert膜的胚胎应丢弃。早期胚胎将无法正常生长或表现出严重的发育迟缓，而胚胎外胚层母细胞附着在板表面将导致进一步胚胎发育的失败。在有缺陷的胚胎中观察到的主要异常是蛋黄袋外后部区域的发育或神经褶皱生长的缺陷。

在从5.5天大的胚胎发育的培养物中，经常观察到发育缺陷是存在小的，不发达的外胚层。使用这种方法，研究人员能够在发育植入后胚胎时进行各种物理或化学操作。例如，操作、细胞移植或谱系追踪。

这种方法不仅为研究小鼠植入后发育铺平了道路，而且还为在来自其他物种（如人类）的胚胎中实施类似的培养方法铺平了道路。