بروتوكولنا يجعل من الأسهل والأسرع فهم العلاقات بين الأجزاء البيولوجية. يمكننا اختبار سلوك العديد من مجموعات متري النسبة للأجزاء في بئر واحدة. تسمح هذه التقنية للباحثين بتوصيف العلاقات المعقدة بين مكونات الدائرة بشكل أكثر شمولا مع كفاءة تجريبية أكبر من الأساليب التقليدية.
تنطبق هذه الطريقة على البيولوجيا التركيبية وعلى أي أسئلة بيولوجية ، حيث تبحث في التغيرات السلوكية في الخلية استجابة لمستويات مختلفة من الجينات المنقولة حيث يمكن قياس الناتج عن طريق قياس التدفق الخلوي. ابدأ في تحضير الأنابيب لكل مجموع من الحمض النووي عن طريق تخصيص أنابيب طرد مركزي صغيرة سعة 1.5 ملليلتر تحمل علامة عدم التحكم في اللون ، والتحكم في mKO2 ، والتحكم في TagBFP ، والتحكم الأخضر النيون ، والتحكم في جميع الألوان ، ومزيج النقل المتعدد واحد ومزيج متعدد النقل اثنين. أضف 36 ميكرولترا من وسط المصل المختزل إلى التحكم في عدم التحكم في اللون ، والتحكم mKO2 ، والتحكم في TagBFP ، والتحكم الأخضر النيون وجميع أنابيب التحكم في الألوان ، ثم أضف 18 ميكرولترا من وسط المصل المختزل إلى كل مزيج متعدد الترانسفيشن واحد ومزيج متعدد الترانسفيكيون أنبوبين.
بعد ذلك ، أضف 600 نانوجرام من بلازميد الحشو إلى أنبوب عدم التحكم في الألوان ، و 300 نانوجرام من mKO2 و 300 نانوجرام من بلازميد الحشو إلى أنبوب التحكم في الألوان mKO2 وأضف 300 نانوجرام من TagBFP و 300 نانوجرام من بلازميد الحشو إلى أنبوب التحكم في الألوان TagBFP. إلى أنبوب التحكم في اللون الأخضر النيون ، أضف 300 نانوجرام من النيون الأخضر التأسيسي و 300 نانوجرام من بلازميد الحشو ، ثم أضف 100 نانوجرام من كل mKO2 و TagBFP وأخضر نيون تأسيسي و 300 نانوجرام من بلازميد الحشو إلى أنبوب التحكم في جميع الألوان. إلى مزيج poly-transfection أنبوب واحد ، أضف 150 نانوجرام من mKO2 ، و 75 نانوجرام من البلازميد الأخضر النيون المراسل و 75 نانوجرام من بلازميد الحشو.
إلى مزيج بولي transfection أنبوبين ، أضف 150 نانوجرام من TagBFP و 75 نانوجرام من بلازميد L7Ae و 75 نانوجرام من بلازميد الحشو. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بإنشاء المزيج الرئيسي للنقل في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر من خلال الجمع بين 216 ميكرولترا من وسط المصل المخفض مع 9.48 ميكرولتر من كاشف النقل. تخلط جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل قبل وضعها جانبا.
أضف 1.58 ميكرولتر من كاشف المحسن إلى عدم التحكم في الألوان ، والتحكم في اللون الفردي وجميع أنابيب التحكم في الألوان وإضافة 79 ميكرولترا من كاشف المحسن إلى كل أنابيب مزيج متعددة النقل. امزج كل أنبوب على حدة عن طريق سحب الإصبع بقوة. أضف 37.58 ميكرولترا من المزيج الرئيسي للنقل إلى عدم التحكم في الألوان والتحكم في اللون الفردي وجميع أنابيب التحكم في الألوان واخلطها عن طريق السحب بقوة.
بعد ذلك ، أضف 18.79 ميكرولترا من المزيج الرئيسي للنقل إلى كل أنبوب مزيج متعدد النقل واخلط كل أنبوب جيدا مع ماصة قوية. قم بتوزيع خلطات النقل في الآبار عن طريق سحب 65.97 ميكرولتر من كل مزيج نقل لعدم وجود لون ولون واحد وجميع عناصر التحكم في الألوان في الآبار المقابلة ، ثم نقل 32.98 ميكرولتر من مزيج النقل المتعدد في بئر النقل المتعدد وتوزيع المعقدات بشكل فعال عن طريق تدوير اللوحة بسرعة ولكن برفق في إحكام ، نمط الشكل على طول سطح مستو ، ثم ماصة 32.98 ميكرولتر من poly-transfection تخلط اثنين في نفس بئر poly-transfection وتدور اللوحة بنفس الطريقة. احتضان الخلايا لمدة يومين.
قم بإجراء قياس التدفق الخلوي لقراءة مضان علامات النقل ومراسل الإخراج لكل خلية. يظهر النقل المشترك جيد الأداء ، والذي يختلف عن النقل المتعدد الموضح في الفيديو ، ارتباطا وثيقا بين TagBFP و EYFP ، معبرا عن البلازميدات التي تم تسليمها بشكل مشترك. في المقابل ، يظهر النقل المشترك ضعيف الأداء ارتباطا ضعيفا بين البلازميدات.
أظهر النقل المتعدد الأداء الجيد تغطية جيدة للفضاء ثنائي الأبعاد وتعويضا جيدا لأي نزيف طيفي بين البروتينات الفلورية. كان من الصعب تقسيم بيانات النقل المتعدد مع عدد قليل من الخلايا الحية إلى صناديق كافية مع عدد كاف من الخلايا في كل حاوية للتحليل. أدى النقل المتعدد مع ضعف كفاءة النقل إلى تغطية متفرقة للمساحة ثنائية الأبعاد للتحليل.
تم اختبار نسبة الحمض النووي الفعالة على تعبير المخرجات عن طريق وضع بروتين مثبط ، L7Ae مع mKO2 ، وبروتين ناتج ، أخضر نيون مع TagBFP ، في خلطات نقل منفصلة. ثم تم رصد التعبير الأخضر النيون على مستويات مختلفة من mKO2 و TagBFP. تمت مقارنة نتائج النقل المشترك والنقل المتعدد لهذه الدائرة.
تم تجميع نتائج 11 عملية نقل مشتركة فردية جمعت أجزاء الحمض النووي الموضحة سابقا في مجموعة بيانات واحدة ومقارنتها ببيانات النقل المتعدد. أظهرت مقارنة منحنيات استجابة الجرعة ل L7Ae قمع مراسل المخرجات أن متوسط مستوى الإخراج لكل حاوية كان مشابها جدا بين بيانات النقل المشترك وبيانات النقل المتعدد. تم إثبات التطبيق الناجح للنقل المتعدد لتحسين مصنف نوع الخلية.
يعمل الحمض النووي الريبي الميكروي -21 الموجود في خلايا هيلا والخلايا غير HEK على هدم تعبير BM3R1 لأن BM3R1 يثبط إنتاج خرج الدائرة mKO2. عند وجود micro RNA 21 في خلية ، سيتم تشغيل تعبير mKO2. مقدار Gal4-VP16 يضبط تعبير mKO2 عند مستويات منخفضة من BM3R1.
تم تسليم كل مكون من مكونات الدائرة بعلامة فلورسنت مختلفة. يحدد هذا النقل المتعدد مقدار كل مكون دائرة تتلقاه كل خلية. يتم إنتاج mKO2 في MIR21 ، وإنتاج خلايا HeLa ولكن ليس في خلايا HEK.
تم تحليل خرج mKO2 بعد تسليم مكونات الدائرة هذه في خلطات نقل منفصلة مع مراسلين فلورسنت متميزين للإشارة إلى كمية كل مكون دائرة تستقبله خلية معينة. تنبأت هذه العينة الفرعية أنه عند هذه النسبة ، كان للدائرة المشتركة المنقولة خصوصية بنسبة 91٪ وحساسية 62٪ ودقة 77٪ ، عند تصنيف خلايا HEK293 مقابل خلايا HeLa. نقطة الألم الأكثر شيوعا في هذا البروتوكول هي عدم وجود ارتباط وثيق داخل كل مزيج نقل.
لذا تذكر أن تخلط أنابيب النقل بقوة بعد إضافة كاشف المحسن مباشرة ثم كن لطيفا مع خلط وسحب أنابيب النقل بعد إضافة مزيج النقل المحتوي على الدهون يمكن استبدال المكونات الجينية في هذا الإجراء بأي مكونات وراثية أخرى للإجابة على أسئلة حول أدائها الوظيفي في بيئات مختلفة. طورت هذه الطريقة بسرعة دوائر وراثية ، مثل مصنفات الخلايا ، والتغذية المرتدة ووحدات التحكم في التغذية الأمامية ، والزخارف ثنائية الاستقرار وغيرها الكثير.
