يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال فيروس نقص المناعة البشرية مثل تحديد التركيب الجيني للفيروسات الفيروسة والأنواع المختلفة من الخلايا. تحديد خاصة تلك التي هي سليمة وراثيا ويحتمل أن تكون مختصة النسخ المتماثل. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يسمح لنا لتضخيم شبه كامل طول فيروس نقص المناعة البشرية proviruses من الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية واحد ومن ثم تسلسل هذه من قبل الجيل القادم التسلسل.
للبدء، قم بإعداد كافة المخازن المؤقتة كما هو موضح في بروتوكول النص. الحصول على بيليه الخلية وإضافة مائة microliters من العازلة تحلل لكل مليون خلية. مزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.
lyse الخلايا عن طريق احتضان في دورة حرارية في 55 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ثم إضافة 85 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. للبدء في تضخيم واحد فيروس نقص المناعة البشرية-1 الحمض النووي proviruses مزيج الكواشف للجولة الأولى PCR كما هو مدرج في الجدول واحد من بروتوكول النص. إضافة 38 ميكروليتر إلى 85 آبار في 96 بئرا PCR لوحة وتسمية هذه اللوحة PCR 1.
بعد ذلك، قم بتحريك لوحة PCR 1 إلى منطقة واضحة مخصصة لإضافة الحمض النووي الجينومي. باستخدام ثلاثي هيدروكلوريد بشكل متسلسل تمييع الحمض النووي الجينومي من نسبة 1 إلى 3 إلى نسبة 1 إلى 81 مع التأكد من إعداد 45 ميكرولترات من كل تخفيف. إضافة اثنين من microliters من الحمض النووي الجينوم المخفف إلى كل عينة بشكل جيد واثنين من ميكرولترات من هيدروكلوريد ثلاثي إلى كل سيطرة سلبية جيدا.
ختم لوحة كاملة باستثناء السيطرة الإيجابية بشكل جيد. بعد ذلك، انتقل إلى منطقة معينة لإضافة عنصر تحكم موجب. إضافة اثنين microliters من السيطرة الإيجابية إلى بئر المقابلة ومن ثم ختم لوحة تماما.
استخدام الدوار لوحة PCR لتدور لفترة وجيزة لوحة PRC 1 وسحب أي محتويات المتبقية من جانبي الآبار. تشغيل لوحة PCR 1 في دورة الحرارية كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم مزج الكواشف للجولة الثانية من الـ PCR كما هو مبين في الجدول الأول.
إضافة 28 ميكرولترات من هذا المزيج PCR 2 إلى 85 آبار من لوحة PCR 96 جيدا جديدة. تسمية هذه اللوحة PCR 2. باستخدام لوحة الدوار، تدور لفترة وجيزة لوحة PCR 1 لسحب أسفل أي محتويات المتبقية من جانبي الآبار.
إضافة 80 ميكرولتردات من هيدروكلوريد ثلاثي إلى كل بئر من هذه اللوحة. بعد ذلك، استخدم ماصة قناة mutli لنقل اثنين من microliters من كل بئر من لوحة PCR 1 إلى الآبار المقابلة في لوحة PCR 2. ختم لوحة PCR 2 مع التفاف لاصق واضح.
تدور لفترة وجيزة لوحة PCR 2 في لوحة الدوار. وفي الوقت نفسه، ختم لوحة PCR 1 مع فيلم ختم الحرارة لتخزين على المدى الطويل في ناقص 20 درجة مئوية. تشغيل لوحة PCR 2 في دورة حرارية كما هو موضح في بروتوكول النص.
ثم تدور لفترة وجيزة لوحة PCR 2 لسحب أسفل أي محتويات المتبقية من جانبي الآبار. باستخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 60 ميكرولترات من هيدروكلوريد ثلاثي إلى كل بئر. المقبل، تشغيل 15 ميكرولترات من كل بئر على اثنين 48 جيدا precast واحد في المئة agarose المواد الهلامية التي تحتوي على بروميد الإتيهيدوم.
تحديد الآبار التي تحتوي على المنتج المكبر وأحجامها التقريبية وحفظ صورة الجل. بعد ذلك، تحديد التخفيف الذي لا يزيد عن 30 في المئة من الآبار إيجابية للمنتج تضخيم. أولاً، استخدم لوحة الدوار لتدور لفترة وجيزة لوحة PCR 2 وسحب أي محتويات المتبقية من جانبي الآبار.
نقل 40 ميكروليتر من الآبار التي تحتوي على المنتج تضخيمها إلى الآبار المقابلة من جديد 96 لوحة ميدي جيدا. المقبل، المنصوص عليها في الأعلاف المغناطيسية مجموعة تنقية التأكد من جلب الخرز المغناطيسي إلى درجة حرارة الغرفة وإعداد حل جديد من الإيثانول 80 في المئة. مرة واحدة في الخرز تصل إلى درجة حرارة الغرفة دوامة لهم لضمان أن يتم إعادة اعتمادها بدقة.
باستخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 40 ميكرولترات من الخرز إلى 40 ميكرولترers من المنتج تضخيم في كل بئر من لوحة ميدي. مزيج عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا 10 مرات. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
ثم، نقل لوحة إلى موقف مغناطيسي والسماح لها بقية لمدة دقيقتين. بعد ذلك، إزالة وتجاهل نابيرانت. مع لوحة لا يزال على الوقوف، وغسل الخرز بإضافة مائتي ميكرولتر من 80 في المئة من محلول الإيثانول لكل بئر.
احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية ثم إزالة وتجاهل supernatant. كرر عملية الغسيل هذه مرة واحدة من إضافة الإيثانول إلى التخلص من المابير. باستخدام ماصة متعددة القنوات إزالة أي الإيثانول الزائد.
دع حبات الهواء تجف لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، قم بإزالة اللوحة من المنصة. إضافة 30 ميكرولتررس من عازلة elution إلى كل بئر ويخلط بلطف الأنابيب صعودا وهبوطا 10 مرات.
احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. ضع اللوحة مرة أخرى على الحامل المغناطيسي واتركها ترتاح لمدة دقيقتين. باستخدام ماصة متعددة القنوات، نقل 25 ميكرولترات من المابير إلى الآبار المقابلة من لوحة PCR 96 جيدا.
بعد ذلك، استخدم مقياس ضوئي طيفي لتحديد وتسجيل التركيز التقريبي لكل منتج من منتجات الحمض النووي المضخم. حدد مجموعة مضاعفة من عينات الحمض النووي التي تقطعت بها السبل وتمييع الحاجز إلى مرة واحدة في مياه خالية من الحمض النووي المعيّن. إضافة 99 ميكرولترات من العازلة إلى عدد مناسب من الآبار الفارغة في لوحة ثقافة الأنسجة السفلي مسطحة.
ثم، إضافة مائة ميكرولترers من المخزن المؤقت إلى ثلاثة آبار فارغة. لكل منتج تضخيم أن يقاس إضافة ميكرولتر واحد من الحمض النووي المنقى في ثلاثية إلى كل عازلة تحتوي على البئر. تمييع لامدا مزدوجة تقطعت بها السبل الحمض النووي 10 أضعاف من اثنين من نانوغرام لكل ميكرولتر إلى نقطة صفر نانوغرام لكل ميكرولتر لإعداد المعايير.
إضافة مائة ميكرولتر من كل معيار الحمض النووي مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل إلى ثلاثة آبار. تمييع صبغة الفلوريسنس من 1 إلى 200 مع المخزن المؤقت. إضافة بسرعة مائة microliters إلى كل بئر يحتوي على عينة، فارغة أو قياسية ومزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.
بعد ذلك، قم بتغطية اللوحة مع احباط لتجنب الاتصال مع الضوء. باستخدام قارئ microplate، تسجيل الانبعاثات الفلوريس. استخدم القياسات المسجلة لتحديد تركيز الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل في كل عينة.
ثم تمييع كل منتج منقّاة بالماء إلى تركيز نقطة صفر اثنين نانوغرام لكل ميكرولتر. بعد PCR متداخلة، يتم تشغيل المنتجات المضخمة على هلام agarose واحد في المئة. ويمكن تحديد الجودة الأولية لل PCR عن طريق فحص الضوابط.
كما الضوابط السلبية التي تحتوي على المنتج تضخيم تشير إلى التلوث والضوابط الإيجابية دون المنتج تضخيم تشير إلى عدم كفاية التضخيم. فقط الآبار التي تعمل عند تخفيف نقطة النهاية التي تحتوي على فيروسات برو مكبرة واحدة تعتبر لتسلسل. في حين أن الآبار التي تحتوي على الفيروسات برو تضخيم متعددة من أطوال مختلفة يمكن تصورها في هذه المرحلة، لا ينبغي أن تكون مختارة لتسلسل.
بالنسبة للتجميع دي نوفو، يمكن تقييم نوعية contigs تجميعها لعمق كاف ومدى الاكتفاء بتغطية. ويمكن أيضا تحديد السكان المختلطين في هذه المرحلة من خلال وجود تغطية متفاوتة. ويكشف التمثيل البصري للتسلسلات المعزولة عن أحد المشاركين أن 97 في المائة من تسلسلها معيب.
مع تسلسل سليمة وجدت في effector والذاكرة الانتقالية CD4 الخلايا T إيجابية. في حين تحاول هذا الإجراء من المهم أن نتذكر أن المنتجات فقط تضخيم التي تم الحصول عليها في التخفيف الحد، وهذا هو المكان الذي لا يزيد عن 30 في المئة من الآبار إيجابية، تحتوي على فيروس بروفيروس واحد. بعد هذا الإجراء، يمكن أن يتم تسلسل المنتجات المضخمة لتحديد التكوين الجيني للفيروسات الفيروس.
بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال فيروس نقص المناعة البشرية لاستكشاف توزيع الفيروسات فيروس نقص المناعة البشرية سليمة وراثيا وأنواع مختلفة من الخلايا في المرضى على العلاج لتحديد حيث سليمة وراثيا ويحتمل أن تكون محاكاة proviruses المختصة إخفاء. لا تنس أن العمل مع الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية يمكن أن تكون خطرة وينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة والعمل في مختبر معتمد في جميع الأحيان أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
