هذا البروتوكول في الأعشاب قياس مستمر من الدوائر الوراثية في القولونية وحساب تقلب الإشارة ونسبة الإشارة إلى الضوضاء في الخلايا البكتيرية الفردية لتقييم أداء الدائرة. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها قابلة للتكيف بسهولة مع سلالات ومختبرات مختلفة ، وتتطلب الحد الأدنى من التدريب وعدم وجود معدات خاصة ، وغير مكلفة نسبيا. الضوضاء هي دور هام في تحديد وظائف النظم البيولوجية.
حاليا، هناك مصلحة في بناء دوائر الجينات على نطاق واسع. يمكن تثبيط هذه الأنظمة عن طريق الضوضاء تأكد من تجفيف العينات بشكل جيد ، للحفاظ على منصات البرد في أربع درجات مئوية لأطول فترة ممكنة ، وقطع وتقسيم الأجزاء بصبر وبلطف. لإعداد البكتيريا للتحليل تلقيح مستعمرة واحدة من ثقافة الإشريكية القولونية المصابة.
على سبيل المثال، دائرة مع مراسل GFP. في أنبوب زجاجي يحتوي على خمسة ملليلتر من مرق LB تكملة ذلك مع المضادات الحيوية ذات الصلة. تنمو الخلايا في 37 درجة مئوية و 250 ثورة في الدقيقة الواحدة في حاضنة تهتز لمدة ساعتين حتى مرق غائم.
في نهاية الحضانة ، قم بتدوير ملليلتر واحد من محلول التخفيف في جهازي طرد مركزي صغير صغير ملليلتر ، ونقل 30 ميكرولتر من البكتيريا والحجم الكامل لمحلول التخفيف إلى أنبوبين ملليلتر جديدين. ثم، احتضان الثقافة لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز قبل بذر 40 إلى 60 ميكرولتر من هذا التعليق على لوحات الثقافة M9. لإعداد البكتيريا للتحليل، تلقيح مستعمرة واحدة من ثقافة الإشريكية القولونية المصابة.
على سبيل المثال، دائرة مع مراسل GFP في أنبوب زجاجي يحتوي على خمسة ملليلترات من مرق LB تكملها المضادات الحيوية ذات الصلة. تنمو الخلايا في 37 درجة مئوية و 250 ثورة في الدقيقة الواحدة في حاضنة تهتز لمدة ساعتين حتى مرق غائم. في نهاية الحضانة ، قم بتدوير ملليلتر واحد من محلول التخفيف في أنبوب طرد مركزي صغير ملليلتر صغير ونقل 30 ميكرولتر من البكتيريا والحجم الكامل لمحلول التخفيف إلى أنبوبين ملليلتر جديدين.
ثم احتضان الثقافة لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز. لإعداد لوحات المجهر، مزيج 112.5 ملليغرام من أجار ذوبان منخفضة مع 40 ملليغرام من أجار، وميليلتر واحد من حمض كازامينو 2٪في قارورة إرلينماير 25 ملليلتر. بعد ذلك ، أضف 8.92 ملليلتر من الحد الأدنى من المتوسط على الشفاه الداخلية لقارورة Erlenmeyer 25 ملليلتر والميكروويف الحل الناتج باختصار ، رشقات نارية من ثانيتين إلى ثلاث ثوان.
ثم تعيين حمام الماء إلى 55 درجة مئوية. عندما يكون الحل واضحا ، ضع قارورة Erlenmeyer 25 ملليلتر في حمام مائي 60 درجة مئوية والسماح لمحلول أجار بالتبريد حتى تنخفض درجة حرارته إلى حوالي 45 إلى 50 درجة مئوية. في حين أن التبريد أجار، وتنظيف مقاعد البدلاء مختبر مع 70٪ الإيثانول وسلس قطعة من الشريط المختبر على مقاعد البدلاء تنظيفها.
وضع غطاء زجاجي واحد زلة على الشريط ووضع زلة غطاء الثاني بالقرب من. إضافة محلول أجار المبردة إلى المضادات الحيوية المناسبة والحل. صب 1.5 ملليلتر من أعدت حديثا إلى حل هلام على زلة الغطاء وضعت على الشريط ووضع زلة الغطاء الثاني على هلام، مع الحرص على تجنب فقاعات.
أعد Erlenmeyer إلى حمام الماء الساخن وغطي زلات الغطاء لمدة 20 دقيقة. تقلب الغطاء لمدة ساعة واحدة حضانة في أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة، قم بإزالة زلات الغطاء من الجل الجاف وقطع وسادة صغيرة من الآغاروز.
أثناء الحضانة ، أضف ست قطرات ميكرولتر من التعليق البكتيري المعد إلى طبق 35 ملليمترا واترك القطرات تجف لمدة 15 إلى 30 دقيقة على الأقل. ثم وضع بعناية لوحة في وقت واحد على قطرة واحدة من البكتيريا والسماح للعينات لتعيين لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لوضع السرير أجار دون تشويه العينة، وضع بعناية لوحة باردة على قطرة مع التنصت لطيف.
لتصوير العينات، قم بإزالة القارورة من الماء واترك محلول الجل يبرد لدرجة حرارة الجسم. صب ثلاثة ملليمترات من الجل على محيط لوحة العينة. عندما توطد agarose، ختم لوحة مع الشريط واستخدام إبرة قياس 25 لقطعة عدة ثقوب في الشريط.
ثم ضع اللوحة رأسا على عقب عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل للسماح للأغاروز بترسيخ كامل ، مع منع ترسب الخلايا. في غضون 24 ساعة، استخدم مجهر كونفوكوكال مضان لتحديد موقع العينة في أدنى تكبير وإشراك نظام التركيز التلقائي للمجهر. تطبيق النفط على الهدف المناسب واستخدام وحدة تحكم منصة لنقل لوحة لنشر النفط بعناية.
ثم إشراك التركيز التلقائي مرة أخرى واتبع الاقتراح الافتراضي ل Z الخطوة المقاطع العرضية لتصوير العينة. يجب أن تظهر الإشريكية القولونية كأشكال مستطيلة سوداء على خلفية بيضاء. والنطاق الديناميكي للإضاءة يجب أن يظهر ارتفاعا في مركزه.
يمكن الكشف عن أحداث الميتوسيس أولا عن طريق المجهر الفلوري بعد 30 دقيقة. على الرغم من أن الخلايا الفردية قد يكون من الصعب الكشف عنها في التكبير منخفضة. يمكن أن تظهر ثقافات الخلايا البكتيرية التي تم إعدادها بنسبة تمييع غير صحيحة أعدادا غير متغيرة من الخلايا ، ويمكن أن تظهر العينات التي تم إعدادها بدون ختم لوحة انكماشا مفرطا ، مما يؤدي إلى فقدان التركيز.
يمكن للخلايا أيضا المسافة البادئة الجل في بحثها عن المواد الغذائية، مما أدى إلى التراص من الخلايا البكتيرية فوق بعضها البعض والمساس أحادي الطبقة الخلية، ومنع الكشف عن الخلايا بشكل فعال وقياس إشارة الفلورسنت موثوق بها. وكما تشير هذه البيانات، فإن مرحلة الخلية في دورة التقسيم لا تؤثر على مستوى الضوضاء، حيث أن نطاقات مختلفة من المنطقة تظهر نفس الاتجاه. وعلاوة على ذلك، لا يلاحظ أي تغيير جوهري في نسبة الإشارة إلى الضوضاء بين GFP وGFP فائقة الجوانب، كما يتضح من هذه البيانات التمثيلية.
عند إجراء هذا الإجراء، يجب الحرص على تحديد نسبة التخفيف الصحيحة للسلالة البكتيرية المستخدمة في التجربة. مقارنة نسبة الإشارة إلى الضوضاء لكل دوائر منظمة لهذا الخط الأساسي يسمح باختيار أفضل دائرة أداء ويمكن أن تكشف عن ظواهر مثيرة للاهتمام
