Araştırmamız, hücreler arası bir enfeksiyon modeli oluşturmak amacıyla staphylococcus aureus enfeksiyonlarına odaklanmaktadır. Bu model, hücreler arası enfeksiyonların altında yatan mekanizma hakkında değerli bilgiler sağlayacak ve bunların önlenmesi ve tedavisi için katı yaşın geliştirilmesine katkıda bulunacaktır. Staphylococcus aureus hücre içi enfeksiyonundaki en son ilerleme, hücre içindeki bakterilerin sağkalımını ve yayılmasını düzenlemek için enfeksiyon mekanizmasını incelemektir ve daha terapötik etkiyi iyileştirmek için ilacı ve yapısal modifikasyonu optimize etmeye katkıda bulunacaktır.
Bu araştırma alanı, hücrelerde bakteri enfeksiyonunu incelemek için hücre kültürü, hücre ortaya çıkan dizileme teknolojisi, yüksek yakıtlı oksi termalleri, gen düzenleme teknolojisi ve diğer ilgili teknolojileri kullanır. Geleneksel enfeksiyon modellerinin aksine, hücre içi enfeksiyonlara özgü deneysel koşulları rafine ettik. Hücreleri staphylococcus aureus ile ayrı ayrı enfekte ettikten sonra, bakteri ile enfekte olmuş hücreler daha sonra hücre içi enfeksiyonlar oluşturmak için farelere aşılanır.
Bu yaklaşım, serbest bakterilerin girişimini en aza indirerek verimliliği artırır ve hücre içi enfeksiyon sürecinin daha doğru bir şekilde tutulmasını sağlar. Yöntemimiz antikor ilaçları geliştirmeye odaklanacak ve gelecekte bakteriyel enfeksiyonları önlemek ve tedavi etmek için ilerleyecektir. % 6'lık bir nişasta suyu hazırlamak için, sığır özü tozu, tripton ve sodyum klorürü bir cam kaba art arda 3 ila 10 ila 5 kütle oranında ekleyin.
100 mililitre çift damıtılmış su ekleyin ve bileşenleri çözmek için karıştırın. Çözeltiyi mikrodalgada ısıtın. Daha sonra, 6 kütle oranında çözünür nişasta ekleyin ve karışımı tamamen eriyene kadar karıştırın.
Et suyunu 121 santigrat derecede 30 dakika otoklavlayın. Sterilize edildikten sonra, suyu bir macun kıvamına gelene kadar dört santigrat derecede saklayın. Fare peritoneal makrofajlarını toplamak için sol elinizi kullanarak farenin boynunu tutun ve kuyruğunu kontrol edin.
Ardından, fareyi başı aşağı bakacak ve karnı yukarı bakacak şekilde çevirin. Fareye üç mililitrelik intraperitoneal %6 nişasta suyu enjeksiyonu uygulayın. 72 saatlik enjeksiyondan sonra, anestezi uygulanmış fareyi kurban edin ve %75 etil alkol ile dezenfekte edin.
Oftalmik makas kullanarak, karın zarını tamamen ortaya çıkarmak için farenin karnını kesin. İntraperitoneal enjeksiyon yoluyla karın boşluğuna 10 mililitre DMEM enjekte edin. Boşluğu yıkamak için karnı bir dakika boyunca hafifçe ovalayın.
Ardından, lavaged sıvıyı 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne toplamak için bir şırınga kullanın. Lavaj sıvısını 300 G'de beş dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücre peletini %10 FBS, penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş 10 mililitre DMEM'de yeniden süspanse edin.
10 mikrolitre hücre süspansiyonu alın ve hücreleri saymak için hücre sayacına ekleyin. DMEM FBS ile hücreleri mililitrede 6 hücrenin gücüne 2 kez 10 konsantrasyonda seyreltin. Altı oyuklu bir plaka üzerine oyuk başına bir mililitre hücre süspansiyonu plakalayın.
Plakayı dört saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçka işleminden sonra, süpernatanı çıkarın. Hücreleri steril PBS ile iki kez yıkayın ve aynı koşullar altında oyuk başına bir mililitre DMEM ile gece boyunca kültürleyin.
Peritoneal makrofajları staphylococcus aureus MRSA-252 ile iki saat inkübe edin. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Mililitre gentamisin başına 100 mikrogram içeren tam DMEM ortamının oyuğuna bir mililitre ekleyin ve% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, peritoneal makrofajları 50 mililitrelik santrifüj tüplerine toplayın. Numuneleri 1000 G'de beş dakika santrifüjleyin.
Hücre içi MRSA-252 ile enfekte olmuş makrofajlara mililitre lizozim başına 10 mikrogram ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Hücreleri PBS ile iki kez yıkadıktan sonra, bir mililitre PBS'de tekrar süspanse edin. Ardından, yaklaşık 20 mikrolitre alikot çıkarın ve hücreleri parçalamak için beş dakika boyunca% 0.1 Triton X-100 ekleyin.
Parçalanmış hücre süspansiyonunun PBS ile seri seyreltmelerini gerçekleştirin ve bunları bir triptik soya burgu plakasına bırakın. Plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, peritoneal makrofajlardaki hücre içi MRSA-252 bakterilerini hesaplamak için bakteri kolonilerini sayın.
Kuyruk damarı genişleyene kadar fareyi bir kızılötesi fizyoterapi lambasının altına yerleştirin. Fareleri rastgele dört gruba ayırın. Farenin kuyruk damarına intravenöz olarak 6 CFU Planktonik MRSA-252'nin gücüne 3 kez 10 enjekte edin.
24 saat sonra, anestezi uygulanmış fareyi kurban edin ve% 75 etil alkol ile iyice dezenfekte edin. Karın derisini kaldırmak için bir elinizle cımbız kullanın ve diğer elinizle oftalmik makas kullanarak cildi kesin. Karın boşluğundaki böbrekleri bulun ve dikkatlice tamamen soyun.
Böbrekleri bir mililitre PBS içeren bir öğütme tüpüne aktarın ve katı doku kalmayana kadar öğütün. Homojenize dokuyu Eppendorf tüpüne dökün. PBS kullanarak doku homojenatının seri seyreltmelerini gerçekleştirin.
Her seyreltmeyi ayrı triptik soya burgu plakalarına yerleştirin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün bakteri kolonilerini sayın ve verileri analiz edin. S.aureus'un hücre içi enfeksiyon modelleri, optimize edilmiş fagositoz koşulları ve makrofajlar içinde hayatta kalan bazı bakterilerle genişletilmiş antibiyotik tedavisi altında başarıyla oluşturulmuştur.
Metisiline dirençli S.aureus ile enfekte olan makrofajlar, süpernatanın artık bakteri içermediği iki saatlik antibiyotik tedavisinden sonra hücre içi bakterileri korudu. İn vivo, farelerde bakteriyel kolonizasyon testleri, vankomisinin hücre dışı S.aureus'u ortadan kaldırdığını, ancak hücre içi bakterileri temizleyemediğini gösterdi.
