私たちの研究は、黄色ブドウ球菌感染症に焦点を当て、細胞間感染モデルの確立を目指しています。このモデルは、細胞間感染の根底にあるメカニズムに関する貴重な洞察を提供し、その予防と治療のための厳格な年齢の発展に貢献します。黄色ブドウ球菌の細胞内感染における最新の進歩は、細胞内の細菌の生存と拡散を調節する感染メカニズムを研究することであり、薬物と構造修飾を最適化して、より多くの治療効果を向上させます。
これらの研究分野では、細胞培養、細胞創製シーケンシング技術、高燃料オキシサーム、遺伝子編集技術、およびその他の関連技術を使用して、細胞内の細菌感染を研究しています。従来の感染モデルとは対照的に、細胞内感染に特有の実験条件を洗練させました。黄色ブドウ球菌を細胞に個別に感染させた後、細菌に感染した細胞をマウスに接種して細胞内感染を確立します。
このアプローチは、遊離細菌の干渉を最小限に抑えることで効率を向上させ、細胞内感染プロセスのより正確な保持を保証します。私たちの手法は、抗体医薬の開発に着目し、将来的には細菌感染症の予防と治療に向けて前進していきます。6%デンプンブロスを調製するには、牛肉抽出物粉末、トリプトン、塩化ナトリウムをガラス容器に3対10〜5の質量比で連続して加えます。
100ミリリットルの二重蒸留水を加え、攪拌して成分を溶解します。溶液を電子レンジで加熱します。次に、可溶性デンプンを質量比6で加え、混合物が完全に溶解するまで攪拌します。
ブロスを摂氏121度で30分間オートクレーブします。滅菌したら、ブロスを摂氏4度でペースト状になるまで保管します。マウス腹膜マクロファージを収集するには、左手を使用してマウスの首をつかみ、その尾を制御します。
次に、マウスを裏返して、頭が下向きになり、腹部が上を向くようにします。マウスに6%デンプンブロスの3ミリリットル腹腔内注射を投与します。.72時間の注射後、麻酔をかけたマウスを犠牲にし、75%エチルアルコールで消毒します。.
眼科用ハサミを使用して、マウスの腹部を切り開き、腹膜を完全に露出させます。腹腔内注射により、10ミリリットルのDMEMを腹腔内に注入します。.腹部を1分間優しくこすり、空洞を洗浄します。
次に、シリンジを使用して、洗浄された液体を50ミリリットルの遠心分離チューブに集めます。洗浄液を300Gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。10%FBS、ペニシリン、およびストレプトマイシンを添加した10ミリリットルのDMEMに細胞ペレットを再懸濁します。
10マイクロリットルの細胞懸濁液を取り、それを細胞カウンターに加えて細胞をカウントします。DMEM FBSを使用して、細胞を1ミリリットルあたり6細胞の累乗で10の2倍の濃度に希釈します。ウェルあたり1ミリリットルの細胞懸濁液を6ウェルプレートにプレートします。
プレートを摂氏37度で5%の二酸化炭素と4時間インキュベートします。インキュベーション後、上清を取り除きます。滅菌PBSで細胞を2回洗浄し、同じ条件下でウェルあたり1ミリリットルのDMEMで一晩培養します。
腹膜マクロファージを黄色ブドウ球菌MRSA-252と2時間インキュベートします。上清を取り除き、PBSで細胞を2回洗います。100μg/ミリリットルのゲンタマイシンを含有する完全DMEM培地を1ウェルあたり1ミリリットル加え、5%二酸化炭素中で摂氏37度で2時間インキュベートします。
インキュベーション後、PBSで細胞を3回洗浄します。細胞スクレーパーを使用して、腹膜マクロファージを50ミリリットルの遠心分離チューブに集めます。サンプルを1000 Gで5分間遠心分離します。
細胞内MRSA-252に感染したマクロファージにリゾチーム1ミリリットルあたり10マイクログラムを加え、摂氏37度で10分間インキュベートします。細胞をPBSで2回洗浄した後、1ミリリットルのPBSに再懸濁します。その後、約20マイクロリットルのアリコートを取り出し、0.1%Triton X-100を5分間添加して細胞を溶解します。
溶解した細胞懸濁液をPBSで段階希釈し、トリプシン大豆オーガープレートに滴下します。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、細菌のコロニーを数えて、腹膜マクロファージの細胞内MRSA-252細菌を計算します。
尾静脈が拡張するまで、マウスを赤外線理学療法ランプの下に置きます。マウスをランダムに4つのグループに分けます。マウスの尾静脈に6 CFU Planktonic MRSA-252の3倍10倍を静脈内注射します。
24時間後、麻酔をかけたマウスを犠牲にし、75%エチルアルコールで徹底的に消毒します。.片方の手でピンセットを使って腹部の皮膚を持ち上げ、もう一方の手で眼科用ハサミで皮膚を切ります。腹腔内の腎臓の位置を特定し、慎重に完全に剥がします。
腎臓を1ミリリットルのPBSが入った粉砕チューブに移し、固形組織が残らなくなるまで腎臓を粉砕します。均質化された組織をエッペンドルフチューブに注ぎます。PBSを使用して組織ホモジネートの段階希釈を行います。
各希釈液を別々のトリプティク大豆オーガープレートにスポットし、摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、細菌のコロニーを数え、データを分析します。黄色ブドウ球菌の細胞内感染モデルは、最適化された食作用条件と長期にわたる抗生物質治療の下で、マクロファージ内で生存する一部の細菌で成功裏に確立されました。
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌に感染したマクロファージは、上清に細菌が含まれなくなったときに、抗生物質治療の2時間後に細胞内細菌を保持しました。In vivoでは、マウスの細菌コロニー形成アッセイにより、バンコマイシンは細胞外黄色ブドウ球菌を排除しましたが、細胞内細菌を除去できなかったことが示されました。
