This work was partly supported by Takeda Science Foundation, Pfizer Academic Contribution and JSPS Postdoctoral Fellowship for Foreign Researchers (FC).

NOT: Bu çalışmada kullanılan suşlar ve malzemeler sırasıyla Tablo 1&#39;de belirtilen ve Malzeme Tablosu vardır. Iletim deneylerinde, N315 ve pozitif türevleri cfr COL CFR geninin donör (N315-45 ve Col-45) olarak kullanılmıştır. Bu suşlar, daha önceden standart konjügasyon protokolü (aşağıya bakınız), aşağıdaki, verici klinik CFR pozitif Staphylococcus epidermidis soyu (ST2) halinde kullanılarak konjugasyon ile elde edilmiştir. Bu suş pSCFS7 benzeri plazmid 7 cfr genini barındırmıştır. 1. Konjugasyon Filtre çiftleşme Yöntemiyle Not: CFR gen (N315-45) 7 (Cm R) taşıyan bir S. aureus N315 suşu verici olarak kullanılmıştır. COL 8 veya Mu50 9 suş (Tet R Cm S) alıcı olarak kullanılmıştır. Çift-dirençli koloniler 32 mg / kloramfenikol ve 8 mg L mevcudiyetinde büyüyebilen (Tet R Cm R) / tetrasiklin L, farazi Transkonjuganlardaki olarak kabul edildi ve koloni PCR ile CFR varlığını tespit etmek ve belirlemek için analiz edilmiştir alıcı duyarlılık profili. <ol><li> Bir kaç değişiklik ile önceden tanımlanmış bir protokole 10 aşağıdaki çekimleri gerçekleştirin: <ol><li> 37 ° C&#39;de çalkalanarak (ve sırasıyla, 32 mg / L kloramfenikol olmadan) triptik soya suyu (TSB) ortam içinde alıcı ve verici arasındaki bir gece boyunca kültür 5 mL hazırlayın. </li><li> Taze TSB ortamı kullanılarak 1 (OD = 1.0 600) gecede kültürlerin optik yoğunluk (OD 600) ayarlayın. Alıcı kültürü 0.5 mL (COL ya Mu50) donör kültürü (N315-45) 0.5 mL karıştırın. karışıma PBS 1 ml ilave edilir. </li><li> 0.45 um&#39;lik bir membran filtre USI üzerine bakteri karışımı aktarınBir vakum pompası sistemi ng. </li><li> Bir koyun kanlı agar plaka üzerinde filtre membranlar koyun. 1 gün süreyle 37 ° C&#39;de inkübe edin. NOT: Bu adımda, zenginleştirilmiş orta çift dirençli hücrelerin büyümesine izin vermek için gereklidir. </li><li> plaka filtre membran dışarı atın ve fosfat tamponlu salin (PBS) 10 ml askıya. Vortex iyi membran üzerine bağlı tüm bakterileri toplamak için. </li><li> Taze TSB kullanılarak bir bakteri süspansiyonu içerisinde seri 10-misli seyreltme sağlayın. TSB agar üzerinde 0-10 -4 seyreltilmiş numune levhalar 100 ul (TSA) levhalarında 32 mg / ml Kloramfenikol ve 8 mg / transkonjugamn seçimi L tetrasiklin ile takviye edilmiştir. Seyreltilmiş süspansiyonu (10 -5 -10 -6) TSA plakaları üzerine tek başına 8 mg / L tetrasiklin plaka 100 ul alıcı sayısını saymak için. 18-24 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Cf varlığı için çift dayanıklı koloniler (varsayılan transkonjugamn) analizKoloni PCR 7 ve duyarlılık profili (antibiyograma) ile r geni. </li><li> Standart mikrodilüsyon yöntemi veya disk difüzyon yöntemi 11&#39;e göre, uygun antibiyotik minimum inhibitör konsantrasyonlar (MIC) ölçerek antibiyogram belirler. Transkonjugamn duyarlılık profili kloramfenikol (ve cfr geni tarafından etkilenen diğer bileşiklerin) hariç, alıcıya aynı olmalıdır. Bu belirleme donör suşu tarafından geliştirilen tetrasiklin direnci ekarte etmek için esastır. </li></ol></li></ol> 2. Faj İletimi Not: Sıphovındae ailesi (laboratuvar stok) ait bakteriyofaj MR83a transdüksiyon deneyleri kullanılmıştır. N315-45 faj enfeksiyonu için CFR verici olarak kullanılmıştır. N315, COL ya da Mu50 suşları alıcı olarak kullanılmıştır. CFR edinimi ab belirlendiAlıcı soyunun ility 32 mg / L kloramfenikol varlığında gelişme. Bu koşullarında yetiştirilen Kolonileri (koloni PCR ile) CFR varlığını belirlemek ve potansiyel kontaminasyonu ekarte etmek duyarlılık profilini belirlemek için analiz edilmiştir. <ol><li> Donör üzerinde faj amplifikasyon <ol><li> (180 rpm) çalkalanarak 37 ° C&#39;de 3.6 mM Ca2 + (NBCaCl 2) ile takviye edilmiş bir besin sıvısının 5 ml N315-45 bir gecelik kültürü hazırlayın. Not: Kalsiyum faj enfeksiyonu için gereklidir. Malzemeler Tablo Bkz. diğer şirketlerden Besin suyu, kalsiyum yağış gibi konuları, olabilir. </li><li> 50 ml cam şişeler veya cam şişeler içinde NBCaCl 2 10 mL&#39;lik bir son hacim içinde 1.000: gece boyunca kültür 1 seyreltilmesi ile alt kültür hazırlayın. (180 rpm) çalkalama ile 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca bakteri büyütün. </li><li> NBCaCl 2 medi içinde seyreltilmiş faj MR83a bir dizi hazırlanmasıum (10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 ve 10 -6). Bakteriyel kültür seyreltilmiş faj 20 ul ekle. Ayrıca, bakteriyel hücre büyümesi için pozitif kontrol olarak hizmet eder ve bir sonraki gün faj titresini belirlemek için kullanılabilen faj enfeksiyonu olmayan bir kontrol kültürü hazırlamak. </li><li> gece boyunca hafifçe çalkalanarak (100 rpm) ile 37 ° C &#39;de kültür büyütün. NOT: bulaşmasını faj fazla değilken hücrelerin bir ölçüde artacaktır; Daha sonra, onlar yüzünden litik döngüsü boyunca faj amplifikasyon lizis fazına girecektir. faj ile kültürler şeffaflık farklı oranlarını gösterir iken faj olmadan kültür, tam büyüme gösterecek. </li><li> katma faj en yüksek seyreltme ile bir ya da iki temizlenir kültür şişeleri seçin. </li><li> 15 mi santrifüj tüplerine kültürleri aktarın. kloroform 250 ul ekleyin ve tüpler tersini iyice karıştırın. </li><li> 5,000 tüpler santrifüj <em&gt; 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca x g. </li><li> yeni tüplere transfer süpernatantlar ve kullanılana kadar 4 ° C&#39;de saklayın. faj en az birkaç ay boyunca stabil, ancak çok uzun süre faj hazırlık depolama titre ve transdüksiyon etkinliğini azaltır: NOT. </li></ol></li><li> Faj titresi Ölçme (faj plak deneyi) <ol><li> besin sıvısı agar (% 1.5 ağar) orta hazırlayın; 55 ° C &#39;de bir su banyosunda sıcak tutmak. 3.6 mM&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar orta otoklavlanmış, 0.5 M CaCI2 çözeltisi ekleyin. 90 mm Petri kapları (NBCaCl 2 tabak) içine dökün. </li><li> Çalkalanarak 37 ° C&#39;de NBCaCl 2 5 ml N315 bir gecelik kültürü hazırlamak; Bu, yukarıda tarif edilen kontrol kültürü (aşama 2.1.3) ile ikame edilebilir. </li><li> NBCaCl 2 200 ul içinde bir gece boyunca kültürün 10 ul ekle ve eşit NBCaCl 2 plaka üzerine yayıldı. zaman yüzey yayılmasını durdurmakPlaka, sıvı ile kaplanır. plaka kurumasını bekleyin. </li><li> Seri 1:10 seyreltme yapın (10 -5 -10 -10) NBCaCl 2 ortamı kullanılarak önceden hazırlanmış faj (aşama 2.1.8) arasında. </li><li> Noktası bakteri ile kaplı plaka üzerine, her faj seyreltme 3 ul. </li><li> 30 ° C&#39;de gece boyunca inkübasyona bırakılır. </li><li> Plak sayıları sayın ve aşağıdaki denklem kullanılarak faj titresi hesaplanır: plak oluşturma birimi (pfu) / ml = plakların sayısı x seyreltme faktörü / lekeli hacmi (3 x 10 mi -3) </li></ol></li><li> faj iletimi NOT: Bir önceki aşamada (2.1.8) &#39;da hazırlanmış faj havuzu, S. aureus suşları içine CFR genin transdüksiyonunu test etmek için kullanılır. Bu deneyde, N315, sütun veya Mu50 alıcı olarak kullanılan türler. <ol><li> (180 rpm) çalkalanarak 37 ° C&#39;de NBCaCl 2 5 ml N315, COL ya da Mu50 gece boyunca kültür hazırlayın. </li><li> t seyreltinO 10 9 pfu / mL ° &#39;ye kadar NBCaCl 2 faj. </li><li> 50 ml&#39;lik bir cam şişe içinde, bir gece boyunca kültür, 500 ul taze NBCaCl 2 500 ul ve faj 1 ml (~ 10 9 pfu / ml) karışımı; enfeksiyonun beklenen (MOI) yumuşak bir 30 dakika (100 rpm) çalkalanarak 37 ° C&#39;de 1 inkübe kanşım aşmamalıdır. Not: hemen önce faj ilavesiyle (endojen restriksiyon enzimleri etkisiz hale getirmek 2 dakika boyunca 52 ° C), alıcı hücrelerin ısı tedavisi verimliliği 12 artırabilir. </li><li> % 20 Na 3 -Citrate 50 ul ekle. 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca hafif sallama devam edin. Not: Na 3 -Citrate kalsiyum ılımlı kenetleyici olarak işlev görür. </li><li> Erimiş beyin kalp infüzyon (BHI) agarı (% 1.5 ağar) orta hazırlayın ve 55 ° C&#39;de bir su banyosu içinde muhafaza edin. </li><li> , 100 ml&#39;lik bir şişeye bakteri faj karışımı aktarın 32 mg / ml ile takviye edilmiş chloramp sıcak BHI agar 50 ml ilavehenicol ve iyice karıştırın. 90 mm Petri kapları içine karışımı dökün. NOT: Bu yöntem, büyüyen koloniler (putatif transdüklenmişler) az sayıda belirlenmesini sağlar. </li><li> 24-48 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe plakası. </li><li> Bundan başka, 32 mg / L kloramfenikol ile takviye edilmiş yeni bir BHI agar plakları üzerine koloniler aktarılarak direnç koloniler (transdüklenmişler) test edin. Kolonisi PCR 7 tarafından cfr genin varlığını doğrulamaktadır. </li></ol></li></ol> 3. Doğal Dönüşüm Not: S. aureus doğal transformasyon deneyi daha önceki çalışmamızda 2 de tarif edilen yönteme göre gerçekleşir. N315 türevi N2-2.1 2, 7, alıcı olarak kullanılmıştır. Bu zorlanma ise, iç çekişi odağı çoğaltılamaz edildi yapısal ekspres sigh 2 şekilde. det içiniç-ifade yetkinlik varyantlarını izole etmek için nasıl ailed prosedürler, bir önceki açıklamasına 2 bakınız. Transfer edilecek direnç marker kloramfenikol değilse, pRIT-nefes (Cm R), daha önce tarif edildiği gibi, 2, iç geçirerek ifade etmek için kullanılabilir. Saflaştırılmış plasmid ya da CFR gelen bütün DNA ekstraktı, S. aureus COL-45 7 transformasyon için donör DNA olarak kullanılmıştır -acquired. <ol><li> Donör DNA&#39;nın hazırlanması <ol><li> TSB 50 mL içeren 300 ml&#39;lik bir şişe içinde 37 ° C&#39;de çalkalama ile COL-45, gece boyunca yetiştirmek 32 mg / L kloramfenikol ile takviye edilmiştir. Kültür, E. coli HST04 taşıyan pHY300 Plazmid (Tet R) kontrol deneyi için plazmid elde etmek için. NOT: HST04 (baraj - / dcm -) DNA genleri 13 metilazıyla yoksundur. DNA, metilazlar olan diğer geleneksel suşlar da kullanmak olabilirDNA metilasyonu devlet dönüşüm verimini etkilemez çünkü d DNA donör hazırlamak. Seçenek olarak ise, S. aureus, COL suşundan saflaştırılmıştır pT181 Plazmid aynı zamanda transformasyon deneyi 2 için bir pozitif kontrol olarak kullanılabilir. </li><li> Santrifüj (4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 8,000 x g) hücreleri toplamak. </li><li> Bütün DNA arındırmak için bir plazmid DNA ekstraksiyon kiti ya da geleneksel DNA saflaştırma yöntemiyle plasmidler ekstrakte edin. </li><li> spektrometresi ile saflaştırılmış DNA sayısal olarak ve kullanılana kadar 4 ° C&#39;de tutun. NOT: dönüşüm deneyi, eski genellikle az bir hafta taze bir DNA hazırlık kullanın. Alt DNA preparatları dönüşümün etkinliğini azaltır. </li></ol></li><li> Dönüşüm deneyi <ol><li> Kültür çalkalanarak 37 ° C&#39;de gece boyunca TSB 5 ml alıcı hücre (N2-2.1). </li><li> 1.5 ml tüp içine gece boyunca kültür 0.5 mi aktarın. precipisantrifüj (4 ° C &#39;de 1 dakika süre ile 10,000 x g) hücreleri Tate. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüp içinde CS2 ortamı 10 mL süspanse. NOT: CS2 orta (Malzeme Tablo orta kompozisyon bakınız) S. aureus 2 doğal dönüşümü için yeterlilik uyaran bir tam sentetik ortamıdır. Örneğin TSB ya BHI gibi diğer standart laboratuvar ortamı, dönüşüm 2, 13 için uygun değildir. </li><li> Geç üstel faz (yaklaşık 8 saat) kadar (180 rpm) çalkalanarak 37 ° C&#39;de bakterileri büyür. </li><li> Santrifüj (4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 5000 xg) hücreleri hasat. </li><li> Taze CS2 ortamı 10 ml tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Hücre süspansiyonuna saflaştırılmış plazmid ya da genom DNA (aşama 3.1.4) 10 ug ekleyin. 37 ° C &#39;de çalkalanır ve 2.5 saat için 180 rpm. Not: DNA ile kısa bir kuluçkalama süresi (&lt;2.5 saat) daha düşük transf nedenormation frekansları. </li><li> Santrifüj (5,000 x g 5 dakika, 4 ° C) hücreleri toplamak. </li><li> BHI ortamı 10 mL tekrar süspansiyon hücreleri. erimiş BHI agar ve 90 ml 32 mg / L kloramfenikol (kontrol deneyinde veya 5 mg / L tetrasiklin) ile (55 ° C) ek hücre süspansiyonu karıştırın. 90 mm Petri kapları içine karışımı dökün. Hızla serin ve agar katılaşmaya edelim. </li><li> 2 gün boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> onların direnç özelliklerini teyit etmek için uygun antibiyotik içeren yeni BHI agar plakalarına (kürdan kullanarak) koloniler aktararak üretilen koloniler (dönüştürücüler) çoğaltmak. Kolonisi PCR 7 tarafından satın direnç geni (cfr veya tetM) onaylayın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lindsay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+variation+and+evolution+of+Staphylococcus+aureus.">Genomic variation and evolution of Staphylococcus aureus.</a> IJMM. 300, 98-103 (2010).</li><li>Morikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+cryptic+secondary+sigma+factor+gene+unveils+natural+competence+for+DNA+transformation+in+Staphylococcus+aureus.">Expression of a cryptic secondary sigma factor gene unveils natural competence for DNA transformation in Staphylococcus aureus.</a> PLoS Pathog. 8, e1003003 (2012).</li><li>Caryl, J. A., O'Neill, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+nucleotide+sequence+of+pGO1,+the+prototype+conjugative+plasmid+from+the+Staphylococci.">Complete nucleotide sequence of pGO1, the prototype conjugative plasmid from the Staphylococci.</a> Plasmid. 62, 35-38 (2009).</li><li>Novick, R. P., Christie, G. E., Penades, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phage-related+chromosomal+islands+of+Gram-positive+bacteria.">The phage-related chromosomal islands of Gram-positive bacteria.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 541-551 (2010).</li><li>Dubey, G. P., Ben-Yehuda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+nanotubes+mediate+bacterial+communication.">Intercellular nanotubes mediate bacterial communication.</a> Cell. 144, 590-600 (2011).</li><li>Dubey, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+Characteristics+of+Bacterial+Nanotubes.">Architecture and Characteristics of Bacterial Nanotubes.</a> Dev cell. 36, 453-461 (2016).</li><li>Cafini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+gene+transmission+of+the+cfr+gene+to+MRSA+and+Enterococcus:+role+of+Staphylococcus+epidermidis+as+a+reservoir+and+alternative+pathway+for+the+spread+of+linezolid+resistance.">Horizontal gene transmission of the cfr gene to MRSA and Enterococcus: role of Staphylococcus epidermidis as a reservoir and alternative pathway for the spread of linezolid resistance.</a> J. Antimicrob. Chemother. 71, 587-592 (2016).</li><li>Dyke, K. G., Jevons, M. P., Parker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penicillinase+production+and+intrinsic+resistance+to+penicillins+in+Staphylococcus+aures.">Penicillinase production and intrinsic resistance to penicillins in Staphylococcus aures.</a> Lancet. 1, 835-838 (1966).</li><li>Kuroda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+genome+sequencing+of+meticillin-resistant+Staphylococcus+aureus.">Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Lancet. 357, 1225-1240 (2001).</li><li>Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+interference+limits+horizontal+gene+transfer+in+staphylococci+by+targeting+DNA.">CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA.</a> Science. 322, 1843-1845 (2008).</li><li>Clinical Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Growth Aerobically - Seventh Edition: Approved Standard M7-A7. , (2006).</li><li>Edwards, R. A., Helm, R. A., Maloy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+DNA+transfer+efficiency+by+temporary+inactivation+of+host+restriction.">Increasing DNA transfer efficiency by temporary inactivation of host restriction.</a> BioTechniques. 26, 892-894 (1999).</li><li>Thi, L. T., Romero, V. M., Morikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall-affecting+antibiotics+modulate+natural+transformation+in+SigH-expressing+Staphylococcus+aureus.">Cell wall-affecting antibiotics modulate natural transformation in SigH-expressing Staphylococcus aureus.</a> J. Antibiot. , (2015).</li><li>Long, K. S., Poehlsgaard, J., Kehrenberg, C., Schwarz, S., Vester, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cfr+rRNA+methyltransferase+confers+resistance+to+Phenicols,+Lincosamides,+Oxazolidinones,+Pleuromutilins,+and+Streptogramin+A+antibiotics.">The Cfr rRNA methyltransferase confers resistance to Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A antibiotics.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 50, 2500-2505 (2006).</li><li>Ando, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction-modification+system+differences+in+Helicobacter+pylori+are+a+barrier+to+interstrain+plasmid+transfer.">Restriction-modification system differences in Helicobacter pylori are a barrier to interstrain plasmid transfer.</a> Mol microbiol. 37, 1052-1065 (2000).</li><li>Evans, B. A., Rozen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+variation+in+transformation+frequency+in+Streptococcus+pneumoniae.">Significant variation in transformation frequency in Streptococcus pneumoniae.</a> ISME J. 7, 791-799 (2013).</li><li>Wilson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+the+natural+transformation+frequency+of+Campylobacter+jejuni+in+liquid+shake+culture.">Variation of the natural transformation frequency of Campylobacter jejuni in liquid shake culture.</a> Microbiology. 149, 3603-3615 (2003).</li><li>McCarthy, A. J., Witney, A. A., Lindsay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+temperate+bacteriophage:+carriage+and+horizontal+gene+transfer+is+lineage+associated.">Staphylococcus aureus temperate bacteriophage: carriage and horizontal gene transfer is lineage associated.</a> Front Cell Infect Microbiol. 2, 6 (2012).</li><li>Lindsay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+genomics+and+the+impact+of+horizontal+gene+transfer.">Staphylococcus aureus genomics and the impact of horizontal gene transfer.</a> IJMM. 304, 103-109 (2014).</li><li>Uchiyama, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intragenus+generalized+transduction+in+Staphylococcus+spp.+by+a+novel+giant+phage.">Intragenus generalized transduction in Staphylococcus spp. by a novel giant phage.</a> ISME J. 8, 1949-1952 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> Bu eser S. aureus genetik belirleyicilerin HGT incelemek için üç büyük yöntem açıklanır. Iletimi ve konjügasyon yıllardır incelenmiştir, ancak doğal dönüşümün mevcudiyeti son 2 tanındı. Böylece, S. aureus HGT üç ana modları hepsi ile donatılmıştır ve hepsi test genetik belirleyicilerinin olası yayma yolları açıklığa kavuşturmak için gereklidir. Bu çalışmanın amacı, tam protokolleri derlemek ve önceden yayınlanmış çalışmalar?...

Staphylococcus aureus, doğal insan ve hayvanların deri ve burun boşluğu yaşar bir ortakçı Gram pozitif bir bakteridir. Bu bakteri türleri hastane ve sağlık ortamlarında hastane enfeksiyonlarının önde gelen nedenidir. Ayrıca, farklı antimikrobiyal bileşiklere direnç geliştirme kabiliyeti küresel bir endişe içine bu bakterinin neden olduğu enfeksiyonların yönetimini yapmıştır. direnç fenotipleri yayılmasında karışan iki ana yollar bilinmektedir: dayanıklı genotiplerin klonal yayılmasını ve bakteriyel havuz arasındaki genetik belirleyicileri yayılmasını. S. aureus, farklı antibiyotik direnç genleri (ve hastalık oluşumunu belirleyen etkenin) durumunda, hareketli genetik elemanlara (MGES) ile ilişkili bulunmuştur 1. S. aureus genomunda bu unsurların varlığı gen kazanılması ve transfer olduğunu gösterirBakteriyel nüfus içinde etik malzeme S. aureus adaptasyonu ve evrim için önemli bir rol oynayabilir. dönüşüm, konjugasyon ve faj iletimi: Genetik materyal, Gram-pozitif bakterilerde HGT üç iyi bilinen mekanizmalarla değiştirilebilir. Dönüşüm serbest DNA alımını kapsar. yetkinlik sahne: yabancı DNA elde etmek için, bakteri hücrelerinin özel bir fizyolojik faz geliştirmek gerekir. Bu aşamada ulaşıldığında, kompetan hücreler, sitoplazmaya DNA taşıyan yeni genetik determinantlar elde edebilmektedir. S. aureus durumunda, doğal transformasyon varlığı en son 2 gösterilmiştir. Buna paralel olarak, bizim grubun kurucu ifade reachin yeteneğine sahip S. aureus işler nasıl gelişme yeterlilik aşamasında ve üzerinde iç çekişi faktörünün ifade alaka (şifreli ikincil transkripsiyon sigma faktörü) ışık tutmuşturDoğal dönüşümü 2 ile dayanıklı fenotipleri edinimi için izin verir g yetkinlik sahne. Konjugasyon başka bir (alıcı), bir canlı hücrenin (donör) DNA iletimi ile ilgili bir süreçtir. Her iki hücreleri, tüpler ya da gözenek gibi özel yapılar tarafından korunması suretiyle, DNA değiştirilmesine olanak verir, doğrudan temas içinde olması gerekmektedir. Bu yöntemle DNA transferi konjugatif makine gerektirir. S. aureus, prototip konjugatif plazmid konjugatif operon traa 3 barındıran PGO1 vardır. Faj transdüksiyon bakteriyofaj enfeksiyonu yoluyla hücreden hücreye DNA transferini içermektedir ve faj kapsid içine yerine viral DNA&#39;nın bakteriyel DNA ambalaj ifade eder. S. aureus izolatlarının çoğu bakteriyofajlar 1 ile lysogenized edilir. stres koşullarında üzerine prophages bakteriyel genom eksize edilebilirE ve litik döngüsü vardiya. Bunlar S. aureus DNA aktarımı için üç iyi bilinen mekanizmalardır. Bu tür &quot;sözde dönüşüm&quot; 2 ve patojenite adaları 4 transferinde faj benzeri sistemler gibi bazı ek aktarım mekanizmaları vardır. Son zamanlarda, bir grup &quot;nanotüpler&quot; komşu hücreler 5, 6 arası (plazmid DNA dahil), hücresel materyallerin transferi dahil, ancak bir izlem çalışması şimdiye kadar diğer gruplardan ortaya olmadığını bildirdi. Konjugasyon, transdüksiyon ve doğal dönüşümü: Bu çalışma üç ana aktarma yollarının ele alarak S. aureus HGT incelemek için gerekli bir metodoloji sağlar. Bu yöntemler ile elde edilen sonuçlar arasındaki CFR gen iletimini (kloramfenikol / florfenikol direnci) yapısını incelemek için kullanılmıştırS. aureus 7 suşları. Bu üç teknik S. aureus MGE iletim soruşturma çok yönlü araçlardır.

<table><tbody><tr><td>Tryptic Soy Broth (TSB)&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson&amp;nbsp;</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion (BHI)</td><td>Becton Dickinson&amp;nbsp;</td><td>211059</td><td></td></tr><tr><td>Nutrient Broth No. 2</td><td>Oxoid</td><td>CM0067</td><td></td></tr><tr><td>Sheep blood agar</td><td>Eiken Chemical Co.,Ltd.</td><td>E-MR96</td><td>Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Agar powder</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>010-08725</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate)</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>191-01785</td><td></td></tr><tr><td>Cellulose Ester Gridded 0.45 &amp;mu;L HAWG filter</td><td>Merck Milipore</td><td>HAWG 02500</td><td></td></tr><tr><td>QIAfilter Plasmid Midi kit</td><td>QIAGEN</td><td>12243</td><td></td></tr></tbody></table>

methodology for the study of horizontal gene transfer in staphylococcus aureus

Ana fırsatçı insan patojeni Staphylococcus aureus önemli bir özelliği, hızlı bir şekilde antibiyotiklere direnç elde etmek için olağanüstü yeteneğidir. Genomik çalışmalar S. aureus yatay gen transferi (HGT) S. aureus evriminde önemli bir rol oynadığını düşündürmektedir mobil genetik elementlerin bulunan birçok virülans ve direnç genleri taşıdığını ortaya koymaktadır. Ancak, yine de, eksik özellikle son zamanlarda bu bakterinin rapor edilmiştir doğal dönüşümü ile ilgili olan S. aureus HGT incelemek için kullanılan metodolojinin tam ve ayrıntılı bir açıklama. Konjugasyon faj iletimi ve doğal dönüşümün Bu çalışma, in vitro, S. aureus HGT incelemek için yararlı olan, üç protokollerini tasvir eder. Phenicols veren bu amaçla, cfr gen (kloramfenikol / florfenikol direnci), linkozamitler, Oksazolidinonlar, Pleuromutilins ve streptogramin A (PhLOPS içinA) fenotipi -karşı kullanılmıştır. S. aureus, diğer suşlar genetik materyaller aktaran geçtiği mekanizmaları anlamak direncin hızlı satın kavrama esastır ve yaygınlaştırma modları gözetim programlarında bildirilen veya gelecekte daha da yayılmasını moduna tahmin etmek netleştirmek için yardımcı olur.

Burada temsil edilen sonuçlar, daha önce yayınlanmıştır (yayıncının izni ile referans 7 uyarlanmıştır). Biz HGT üç mekanizmaları araştırmak düşük düzeyli linezolid direnci ve S. aureus suşları PhLOPSA dirençli fenotip 14, 15 ifade edilmesine neden olur CFR geninin, potansiyel iletim yollarını inceledi. ...

Watch this Scientific Journal Video about Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus at JoVE.com

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Burada Staphylococcus aureus konjugasyon, transdüksiyon ve doğal dönüşümün, in vitro incelenmesi için, üç farklı protokoller açıklanmaktadır.

Yatay Gen Transferi Çalışmasında Metodolojisi<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

methodology-for-study-horizontal-gene-transfer-staphylococcus

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

16.4K Görüntüleme.  University of Tsukuba.  Burada Staphylococcus aureus konjugasyon, transdüksiyon ve doğal dönüşümün, in vitro incelenmesi için, üç farklı protokoller açıklanmaktadır. 

Video: Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

Bakteriyel Konjugasyon ilgilendim Transferi Proteinlerin Dizi özgü Analiz konjugatif Çiftleşme Tahliller

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Genetik

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the abundances of key metabolites to which regulatory factors respond, adjusting cellular metabolism. In recent years, a number of proteins and RNA have emerged as important regulators of virulence gene expression. For example, the CodY protein responds to levels of branched-chain amino acids and GTP and is widely conserved in low G+C Gram-positive bacteria. As a global regulator in Staphylococcus aureus, CodY controls the expression of dozens of virulence and metabolic genes. We hypothesize that S. aureus uses CodY, in part, to alter its metabolic state in an effort to adapt to nutrient-limiting conditions potentially encountered in the host environment. This manuscript describes a method for extracting and analyzing metabolites from S. aureus using liquid chromatography coupled with mass spectrometry, a protocol that was developed to test this hypothesis. The method also highlights best practices that will ensure rigor and reproducibility, such as maintaining biological steady state and constant aeration without the use of continuous chemostat cultures. Relative to the USA200 methicillin-susceptible S. aureus isolate UAMS-1 parental strain, the isogenic codY mutant exhibited significant increases in amino acids derived from aspartate (e.g., threonine and isoleucine) and decreases in their precursors (e.g., aspartate and O-acetylhomoserine). These findings correlate well with transcriptional data obtained with RNA-seq analysis: genes in these pathways were up-regulated between 10- and 800-fold in the codY null mutant. Coupling global analyses of the transcriptome and the metabolome can reveal how bacteria alter their metabolism when faced with environmental or nutritional stress, providing potential insight into the physiological changes associated with nutrient depletion experienced during infection. Such discoveries may pave the way for the development of novel anti-infectives and therapeutics.

Here we describe a protocol for the extraction of metabolites from Staphylococcus aureus and their subsequent analysis via liquid chromatography and mass spectrometry.

metabolit analizi için bir Tandem Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi tabanlı yaklaşım<em&gt; Stafilokok aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Biyokimya

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons of conjugation frequency under different conditions are required to understand how the conjugative element spreads in nature. However, conventional methods for comparing conjugation frequency are not appropriate for in-depth comparisons because of the high background caused by the occurrence of additional conjugation events on the selective plate. We successfully reduced the background by introducing a most probable number (MPN) method and a higher concentration of antibiotics to prevent further conjugation in selective liquid medium. In addition, we developed a protocol for estimating the probability of how often donor cells initiate conjugation by sorting single donor cells into recipient pools by fluorescence-activated cell sorting (FACS). Using two plasmids, pBP136 and pCAR1, the differences in conjugation frequency in Pseudomonas putida cells could be detected in liquid medium at different stirring rates. The frequencies of conjugation initiation were higher for pBP136 than for pCAR1. Using these results, we can better understand the conjugation features in these two plasmids.

With an aim to understand the behaviors of various bacterial conjugative DNA elements under different conditions, we describe a protocol for detecting differences in conjugation frequency, with high resolution, to estimate how efficiently the donor bacterium initiates conjugation.

Bakteriyel konjugasyon frekans yüksek çözünürlüklü karşılaştırma

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some factors act directly on virulence genes; others control pathogenesis by adjusting the expression of downstream regulators or the accumulation of signals that affect regulator activity. While regulation has been studied extensively during in vitro growth, relatively little is known about how gene expression is adjusted during infection. Such information is important when a particular gene product is a candidate for therapeutic intervention. Transcriptional approaches like quantitative, real-time RT-PCR and RNA-Seq are powerful ways to examine gene expression on a global level but suffer from many technical challenges including low abundance of bacterial RNA compared to host RNA, and sample degradation by RNases. Evaluating regulation using fluorescent reporters is relatively easy and can be multiplexed with fluorescent proteins with unique spectral properties. The method allows for single-cell, spatiotemporal analysis of gene expression in tissues that exhibit complex three-dimensional architecture and physiochemical gradients that affect bacterial regulatory networks. Such information is lost when data are averaged over the bulk population. Herein, we describe a method for quantifying gene expression in bacterial pathogens in situ. The method is based on simple tissue processing and direct observation of fluorescence from reporter proteins. We demonstrate the utility of this system by examining the expression of Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), whose gene product is required for immune evasion and full virulence ex vivo and in vivo. We show that nuc-gfp is strongly expressed in renal abscesses and reveal heterogeneous gene expression due in part to apparent spatial regulation of nuc promoter activity in abscesses fully engaged with the immune response. The method can be applied to any bacterium with a manipulatable genetic system and any infection model, providing valuable information for preclinical studies and drug development.

Described here is a method for analyzing bacterial gene expression in animal tissues at a cellular level. This method provides a resource for studying the phenotypic diversity occurring within a bacterial population in response to the tissue environment during an infection.

Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Etkileşimi incelenmesi<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Akım Sitometri ve Time Lapse Mikroskopi tarafından Nötrofiller ile

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Heuristic Mining of Hierarchical Genotypes and Accessory Genome Loci in Bacterial Populations

Routine and systematic use of bacterial whole-genome sequencing (WGS) is enhancing the accuracy and resolution of epidemiological investigations carried out by Public Health laboratories and regulatory agencies. Large volumes of publicly available WGS data can be used to study pathogenic populations at a large scale. Recently, a freely available computational platform called ProkEvo was published to enable reproducible, automated, and scalable hierarchical-based population genomic analyses using bacterial WGS data. This implementation of ProkEvo demonstrated the importance of combining standard genotypic mapping of populations with mining of accessory genomic content for ecological inference. In particular, the work highlighted here used ProkEvo-derived outputs for population-scaled hierarchical analyses using the R programming language. The main objective was to provide a practical guide for microbiologists, ecologists, and epidemiologists by showing how to: i) use a phylogeny-guided mapping of hierarchical genotypes; ii) assess frequency distributions of genotypes as a proxy for ecological fitness; iii) determine kinship relationships and genetic diversity using specific genotypic classifications; and iv) map lineage differentiating accessory loci. To enhance reproducibility and portability, R markdown files were used to demonstrate the entire analytical approach. The example dataset contained genomic data from 2,365 isolates of the zoonotic foodborne pathogen Salmonella Newport. Phylogeny-anchored mapping of hierarchical genotypes (Serovar -&#62; BAPS1 -&#62; ST -&#62; cgMLST) revealed the population genetic structure, highlighting sequence types (STs) as the keystone differentiating genotype. Across the three most dominant lineages, ST5 and ST118 shared a common ancestor more recently than with the highly clonal ST45 phylotype. ST-based differences were further highlighted by the distribution of accessory antimicrobial resistance (AMR) loci. Lastly, a phylogeny-anchored visualization was used to combine hierarchical genotypes and AMR content to reveal the kinship structure and lineage-specific genomic signatures. Combined, this analytical approach provides some guidelines for conducting heuristic bacterial population genomic analyses using pan-genomic information.

This analytical computational platform provides practical guidance for microbiologists, ecologists, and epidemiologists interested in bacterial population genomics. Specifically, the work presented here demonstrated how to perform: i) phylogeny-guided mapping of hierarchical genotypes; ii) frequency-based analysis of genotypes; iii) kinship and clonality analyses; iv) identification of lineage differentiating accessory loci.

Bakteriyel Popülasyonlarda Hiyerarşik Genotiplerin ve Aksesuar Genom Loci'nin Sezgisel Madenciliği

Routine and systematic use of bacterial whole-genome sequencing (WGS) is enhancing the accuracy and resolution of epidemiological investigations carried ...

Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli

Conjugation represents one of the main mechanisms facilitating horizontal gene transfer in Gram-negative bacteria. This work describes methods for the study of the mobilization of naturally occurring conjugative plasmids, using two naturally-occurring plasmids as an example. These protocols rely on the differential presence of selectable markers in donor, recipient, and conjugative plasmid. Specifically, the methods described include 1) the identification of natural conjugative plasmids, 2) the quantification of conjugation rates in solid culture, and 3) the diagnostic detection of the antibiotic resistance genes and plasmid replicon types in transconjugant recipients by polymerase chain reaction (PCR). The protocols described here have been developed in the context of studying the evolutionary ecology of horizontal gene transfer, to screen for the presence of conjugative plasmids carrying antibiotic-resistance genes in bacteria found in the environment. The efficient transfer of conjugative plasmids observed in these experiments in culture highlights the biological relevance of conjugation as a mechanism promoting horizontal gene transfer in general and the spread of antibiotic resistance in particular.

Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli

Conjugation mediates horizontal gene transfer by mobilizing plasmid DNA across two different cells, facilitating the spread of beneficial genes. This work describes a widely-used method for the efficient detection of conjugative plasmid transfer, based on the use of differential markers in the conjugative plasmid, donor, and recipient to detect transconjugation.

E. coli'de Doğal Konjugatif Plazmidlerin Aracılık Ettiği Yatay Gen Transferinin Saptanması

Conjugation represents one of the main mechanisms facilitating horizontal gene transfer in Gram-negative bacteria. This work describes methods for the ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

bir Genotiplendirme<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Tarafından Ribozomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Bakteriyel Patojenlerde Antibiyotik Kalıcılığının Görselleştirilmesi

Time-Lapse Epifluorescence Microscopy Imaging of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Heterogeneous Phenotypes

Antibiotic persistence is a phenomenon in which a small number of bacterial cells in a genetically susceptible population survive antibiotic treatment that kills the other genetically identical cells. Bacterial persisters can resume replication once antibiotic treatment ends and are commonly thought to&#160;underlie clinical treatment failure.&#160;Recent work harnessing the power of time-lapse fluorescence microscopy, in which bacteria are labeled with fluorescent transcriptional reporters, translational reporters, and/or dyes for a variety of cellular features, has advanced our understanding of Escherichia coli persisters beyond what could be learned from population-level antibiotic survival assays. Such single-cell approaches, rather than bulk population assays, are essential for delineating the mechanisms of persister formation, damage response, and survival. However, methods for studying persisters in other important pathogenic species at this level of detail remain limited.
This study provides an adaptable approach for time-lapse imaging of Pseudomonas aeruginosa (a gram-negative rod) and Staphylococcus aureus (a gram-positive coccus)&#160;during antibiotic treatment and recovery. We discuss molecular genetic approaches to introduce fluorescent reporters into these bacteria. Using these reporters, as well as dyes, we can track the phenotypic changes, morphological features, and fates of individual cells in response to antibiotic treatment. Additionally, we are able to observe the phenotypes of individual persisters as they resuscitate following treatment. In all, this work serves as a resource for those interested in tracking the survival and gene expression of individual antibiotic-treated cells, including persisters, both during and after treatment, in clinically important pathogens.

<meta charset="utf8"></head><body>Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus Heterojen Fenotiplerinin Hızlandırılmış Epifloresan Mikroskobu Görüntülemesi

In this manuscript, we provide a comprehensive protocol for assessing antibiotic survival for Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus, transforming plasmids into P. aeruginosa and S. aureus to create reporter strains and visualize&#160;phenotypic variants, such as persisters, by time-lapse epifluorescence&#160;microscopy.

Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus Heterojen Fenotiplerinin Hızlandırılmış Epifloresan Mikroskobu Görüntülemesi

Antibiotic persistence is a phenomenon in which a small number of bacterial cells in a genetically susceptible population survive antibiotic treatment ...

Yatay Gen Transferi Çalışmasında Metodolojisi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Bakteriyel Konjugasyon ilgilendim Transferi Proteinlerin Dizi özgü Analiz konjugatif Çiftleşme Tahliller

metabolit analizi için bir Tandem Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi tabanlı yaklaşım

Bakteriyel konjugasyon frekans yüksek çözünürlüklü karşılaştırma

Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

Etkileşimi incelenmesi

Bakteriyel Popülasyonlarda Hiyerarşik Genotiplerin ve Aksesuar Genom Loci'nin Sezgisel Madenciliği

E. coli'de Doğal Konjugatif Plazmidlerin Aracılık Ettiği Yatay Gen Transferinin Saptanması

bir Genotiplendirme

Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus Heterojen Fenotiplerinin Hızlandırılmış Epifloresan Mikroskobu Görüntülemesi

Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus Heterojen Fenotiplerinin Hızlandırılmış Epifloresan Mikroskobu Görüntülemesi