Yeni Bir Damga Cihazı Kullanılarak İki Boyutlu Hücre Kültürlerinden Üç Boyutlu Sferoidlerin/Organoidlerin Üretilmesi

Araştırmamızın kapsamı, agaroz kalıplarında yenilikçi basamak tabanlı mikrokuyu sistemi kullanarak üç boyutlu hücre kültürleri oluşturmak için verimli ve tekrarlanabilir bir protokol oluşturmaktır. Uyuşturucu testi, gen mühendisliği ve ilgili uygulamalar için tek tip, yüksek kaliteli 3D kültürleri teşvik eden basitleştirilmiş, kontrollü ortamın nasıl oluşturulacağına cevap vermeyi amaçlıyoruz. 3D hücre kültürü sistemlerindeki son gelişmeler, hücre etkileşimlerini iyileştirir ve daha fazla in vivo benzeri ortamlar yaratır.

Bu yaklaşım, küresel organoid oluşumunu artırarak onu biyomedikal araştırmalar için umut verici bir araç haline getirir. 3D hücre kültürü için mevcut teknolojiler, asılı damlaları, dönen hücre kültürünü, düşük bağlantılı plastikleri, konik kuyulu plakaları, mikro gözenekli iskeleleri, manyetik boncukları ve iskele içermeyen hidrojelleri içerir. Bu yöntemler, her biri kendi avantajları ve sınırlamaları olan 3D hücre yapılarının oluşumunu sağlar.

Protokolümüz, büyük ölçekte tutarlı boyut ve kaliteye sahip tek tip 3D sferoidler ve organoidler üretme zorluğunu ele almaktadır. Canlılık ve hücre yoğunluğu sorunlarını, işlem sırasında ele alma zorluklarını ve kararsızlığı çözerek, güvenilir 3D hücre kültürleri araştırmaları için uygun maliyetli, tekrarlanabilir bir çözüm olduğunu kanıtlar. Araştırma araçlarında iyileştirme, in vitro analiz için insülin üreten beta hücrelerinin sferoid organoidlerinin üretilmesi ve biyopolimerlerde kapsüllenme, Tip I diyabetin geri döndürülmesini ve üçlü negatif insan meme kanseri hücrelerinden sferoid organoidlerinin üretilmesini amaçlayan bir ilaç tarama platformu olarak kararlıyız.

Belirtilen yazılımı kullanarak damga cihazını tasarlayın. Kalıntıları gidermek için ısmarlama damgayı yumuşak kıllı bir sünger ve damıtılmış su ile yıkayın. Steriliteyi sağlamak için temiz damgayı beş ila 10 dakika ultraviyole ışığa maruz bırakın.

% 1 ila 2 agaroz çözeltisi hazırlamak için, gerekli miktarda saf agaroz tozunu tartın ve PBS'de çözün. Agaroz tamamen eriyene kadar çözeltiyi bir mikrodalgada ısıtın. Daha sonra, 40 santigrat derece agaroz çözeltisinin yaklaşık üç mililitresini altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna pipetleyin.

Damgayı kuyunun ortasına yerleştirin ve agarozun 5 ila 10 dakika katılaşmasına izin verin. Katılaşmadan sonra, mikro kuyucuklara zarar vermeden vakumu serbest bırakmak için hafif ileri geri hareketlerle damgayı çıkarın. Kalıntıları gidermek için mikro kuyuları PBS ile üç kez yıkayın.

Mikrobiyal kontaminasyonu ortadan kaldırmak için plakayı 10 dakika boyunca ultraviyole ışığa maruz bırakın. Altı kuyucuklu plakanın her bir oyuğuna üç mililitre kültür ortamı ekleyin ve plakayı bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede gece boyunca inkübe edin. Domuz pankreas adacıklarının homojen bir süspansiyonunu elde etmek için, hücreleri ayırmak için iki boyutlu bir hücre kültürüne tripsin ekleyin.

Ardından, hücreleri sayın ve altı oyuklu bir plakanın mikro kuyusu başına istenen hücre sayısını elde etmek için konsantrasyonu ayarlayın. Üç mililitre hücre süspansiyonunu agaroz mikrokuyularının üzerine pipetleyin ve eşit dağılımı sağlamak için plakayı döndürün. Hücrelerin yerçekimi ile 10 ila 15 dakika yerleşmesine izin verin.

Daha sonra çöken hücreleri mikroskop altında gözlemleyin. Plakayı% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin. Her iki ila üç günde bir, eski veya kullanılmış ortamın% 50'sini yeni ortamla değiştirin.

Kompakt, üç boyutlu yapılar tamamen oluşana kadar kültürlemeye devam edin. Sferoidleri veya organoidleri toplamak için kültür ortamını çıkarın ve kesilmiş bir pipet ucu kullanarak üç boyutlu yapıları kuvvetli pipetleme yoluyla toplayın. Kompakt üç boyutlu yapılar, zamana bağlı hücre agregasyonu yoluyla gözlemlendiği gibi, agaroz mikro kuyularında 48 saatlik kültürleme ile başarılı bir şekilde oluşturuldu.

Canlı üç boyutlu yapılar, yapılar içindeki canlı hücreleri gösteren yeşil boyama ile agaroz mikro kuyularından çıkarıldıktan sonra korundu, bu da hücre canlılığını ve stabilitesini doğruladı.