Geração de esferoides/organoides tridimensionais a partir de culturas de células bidimensionais usando um novo dispositivo de carimbo

O escopo de nossa pesquisa é estabelecer um protocolo eficiente e reprodutível para geração de culturas de células tridimensionais usando um sistema inovador de micropoços baseado em etapas em moldes de agarose. Nosso objetivo é responder como criar um ambiente simplificado e controlado que promova culturas 3D uniformes e de alta qualidade para testes de medicamentos, engenharia genética e aplicações relacionadas. Avanços recentes em sistemas de cultura de células 3D melhoram as interações celulares e criam mais ambientes semelhantes a in vivo.

Essa abordagem aumenta a formação de organoides esferoides, tornando-a uma ferramenta promissora para pesquisas biomédicas. As tecnologias atuais para cultura de células 3D incluem gotas suspensas, cultura de células rotativas, plásticos de baixa fixação, placas com poços cônicos, andaimes microporosos, esferas magnéticas e hidrogéis sem andaimes. Esses métodos permitem a formação de estruturas celulares 3D, cada uma com suas próprias vantagens e limitações.

Nosso protocolo aborda o desafio de gerar esferoides e organoides 3D uniformes com tamanho e qualidade consistentes em larga escala. Ele resolve problemas de viabilidade e densidade celular, dificuldades de manuseio e instabilidade durante o processo, provando ser uma solução econômica e reprodutível para pesquisas confiáveis de culturas de células 3D. Estamos comprometidos em buscar o aprimoramento das ferramentas de pesquisa, geração de organoides esferoides de células beta produtoras de insulina para análise in vitro e encapsulamento em biopolímeros, visando a reversão do diabetes tipo I e geração de organoides esferoides a partir de células de câncer de mama humano triplo-negativo como plataforma de triagem de medicamentos antes do tratamento do paciente.

Projete o dispositivo de carimbo usando o software especificado. Lave o carimbo feito sob medida com uma esponja de cerdas macias e água destilada para remover quaisquer resíduos. Exponha o carimbo limpo à luz ultravioleta por cinco a 10 minutos para garantir a esterilidade.

Para preparar uma solução de 1 a 2% de agarose, pese a quantidade necessária de pó de agarose puro e dissolva-o em PBS. Aqueça a solução no micro-ondas até que a agarose esteja completamente dissolvida. Em seguida, pipete aproximadamente três mililitros da solução de agarose a 40 graus Celsius em cada poço de uma placa de seis poços.

Coloque o carimbo no centro do poço e deixe a agarose solidificar por 5 a 10 minutos. Após a solidificação, remova o carimbo com movimentos suaves para frente e para trás para liberar o vácuo sem danificar os micropoços. Lave os micropoços três vezes com PBS para remover os resíduos.

Exponha a placa à luz ultravioleta por 10 minutos para eliminar a contaminação microbiana. Adicione três mililitros de meio de cultura a cada poço da placa de seis poços e incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono. Para obter uma suspensão homogênea de ilhotas pancreáticas suínas, adicione tripsina a uma cultura de células bidimensional para dissociar as células.

Em seguida, conte as células e ajuste a concentração para atingir o número desejado de células por micropoço de uma placa de seis poços. Pipete três mililitros da suspensão celular sobre os micropoços de agarose e gire a placa para garantir uma distribuição uniforme. Deixe as células assentarem por gravidade por 10 a 15 minutos.

Em seguida, observe as células sedimentadas ao microscópio. Incube a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono. A cada dois ou três dias, substitua 50% do meio velho ou gasto por meio novo.

Continue cultivando até que estruturas tridimensionais compactas estejam totalmente formadas. Para coletar esferóides ou organoides, remova o meio de cultura e, usando uma ponta de pipeta cortada, colete as estruturas tridimensionais por meio de pipetagem vigorosa. Estruturas tridimensionais compactas foram formadas com sucesso por 48 horas de cultivo em micropoços de agarose, conforme observado por meio da agregação celular dependente do tempo.

Estruturas tridimensionais viáveis foram retidas após a remoção de micropoços de agarose com coloração verde indicando células vivas dentro das estruturas, confirmando a viabilidade e estabilidade celular.