新規スタンプデバイスを用いた二次元細胞培養からの三次元スフェロイド/オルガノイドの作製

私たちの研究の範囲は、アガロース型における革新的なステップベースのマイクロウェルシステムを使用して、3次元細胞培養を作製するための効率的で再現性のあるプロトコールを確立することです。私たちは、薬物試験、遺伝子工学、および関連アプリケーションのための均一で高品質な3D培養を促進する、簡素化された制御された環境をどのように作り出すかを明らかにすることを目指しています。3D細胞培養システムの最近の進歩により、細胞間相互作用が改善され、in vivo様環境がより多く作り出されます。

このアプローチは、スフェロイドオルガノイドの形成を促進し、生物医学研究の有望なツールとなっています。現在の3D細胞培養技術には、吊り下げ式、回転式細胞培養、低付着性プラスチック、円錐形ウェル付きプレート、微多孔質スキャフォールド、磁気ビーズ、スキャフォールドフリーハイドロゲルなどがあります。これらの方法により、3D細胞構造の形成が可能になり、それぞれに独自の利点と制限があります。

当社のプロトコールは、一貫したサイズと品質で均一な3Dスフェロイドとオルガノイドを大規模に作製するという課題に取り組んでいます。生存率と細胞密度の問題を解決し、プロセス中の困難と不安定性に対処し、信頼性の高い3D細胞培養研究のための費用対効果が高く再現性のあるソリューションであることを証明します。私たちは、I型糖尿病の復帰を目指し、インスリン産生β細胞のインスリン産生β細胞のオルガノイドを作製し、生体高分子に封入する研究ツールの改良や、トリプルネガティブヒト乳がん細胞からのスフェロイドオルガノイドの作製を、治療前の薬物スクリーニングプラットフォームとして追求しています。

指定のソフトウェアを使用してスタンプデバイスを設計します。カスタムメイドのスタンプを柔らかい毛のスポンジと蒸留水で洗い、残留物を取り除きます。クリーンスタンプを紫外線に5〜10分間さらして、無菌性を確保します。

1〜2%アガロース溶液を調製するには、必要量の純粋なアガロース粉末を秤量し、PBSに溶解します。アガロースが完全に溶解するまで、溶液を電子レンジで加熱します。次に、摂氏40度のアガロース溶液の約3ミリリットルを6ウェルプレートの各ウェルにピペットで移します。

スタンプをウェルの中央に置き、アガロースを5〜10分間固化させます。固化後、マイクロウェルを傷つけずに真空を放出するために、緩やかな前後の動きでスタンプを取り外してください。マイクロウェルをPBSで3回洗浄し、残留物を取り除きます。

プレートを紫外線に10分間さらして、微生物汚染を排除します。6ウェルプレートの各ウェルに3ミリリットルの培地を加え、プレートを二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で一晩インキュベートします。ブタ膵島の均質な懸濁液を得るためには、二次元細胞培養物にトリプシンを添加して細胞を解離させます。

次に、細胞をカウントし、濃度を調整して、6ウェルプレートのマイクロウェルあたりの細胞数を所望の細胞数にします。細胞懸濁液の3ミリリットルをアガロースマイクロウェル上にピペットで移動し、プレートを渦巻いて均一に分布させます。細胞が重力によって10〜15分間沈殿するのを待ちます。

次に、定着した細胞を顕微鏡で観察します。プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素インキュベーターでインキュベートします。2〜3日ごとに、古い培地または使用済みの培地の50%を新しい培地と交換します。

コンパクトで立体的な構造が完全に形成されるまで培養を続けます。スフェロイドやオルガノイドを採取するには、培地を取り出し、カットしたピペットチップを使用して、激しいピペッティングで三次元構造を採取します。アガロースマイクロウェルでの48時間の培養により、コンパクトな三次元構造の形成に成功し、時間依存的な細胞凝集を通じて観察されました。

アガロースマイクロウェルから取り出しても生存可能な三次元構造が保持され、構造内の生細胞を示す緑色染色により、細胞の生存率と安定性が確認されました。