Japon ensefalit virüsüne özgü TPFS'nin tespit yöntemi ve akış sitometrisi renk şeması, benzer çalışmalar için bir referans sağlamak üzere test edilmiştir. Prosedürün gösterilmesi, laboratuvarımızdan iki öğrenci olan Linlin Zhang ve Meng Zhang tarafından gerçekleştirilecektir. Başlamak için, JEV stimülasyon grubunun PBMC'lerini, monoklonal antikorlar, CD28 ve CD49d, CD107a, GolgiPlug ve monensin varlığında 37 santigrat derecede 16 saat boyunca konsantre inaktive edilmiş JEV parçacıkları ile uyarın.
Daha sonra, kontrol grubunun PBMC'lerini, konsantre virüs parçacıkları olmadan, monoklonal antikorlar, CD28 ve CD49d, CD 107a, GolgiPlug ve monensin varlığında 37 santigrat derecede 16 saat boyunca uyarın. Her gruptan hücre süspansiyonunu 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 g'da santrifüj yapın ve süpernatantı bir pipetle çıkarın.
Hücreleri 1 mililitre PBS'de yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonuna sabitlenebilir canlılık boyası ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Beş dakika boyunca oda sıcaklığında 500 g'da santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın.
Hücreleri 1 mililitre PBS'de yeniden askıya aldıktan sonra, yine, beş dakika boyunca oda sıcaklığında 500 g'da santrifüj yapın ve daha önce gösterildiği gibi süpernatantı atın. Hücre yüzey işaretleyici boyama işlemini gerçekleştirmek için, hücreleri 100 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın ve her tüpteki hücre süspansiyonuna her yüzey işaretleyici antikorundan iki mikrolitre ekleyin. Tüpleri ışıktan korurken oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
Beş dakika boyunca 500 g'da santrifüj yapın ve daha önce gösterildiği gibi süpernatantı çıkarın. Yine, hücreleri bir mililitre PBS'de yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 g'da santrifüj yapın ve süpernatantı dikkatlice atın.
Fiksasyon ve membran kırma işlemini gerçekleştirmek için, hücreleri 500 mikrolitre membran kırıcı fiksatif çözelti ile yeniden askıya alın ve hücreleri oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika sabitleyin. Daha sonra beş dakika boyunca 500 g'da santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Hücreleri bir mililitre PBS'de yeniden askıya aldıktan sonra, oda sıcaklığında 500 g'da beş dakika boyunca santrifüj yapın ve daha önce gösterildiği gibi süpernatantı dikkatlice çıkarın.
Daha sonra, hücreleri 100 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın ve hücre içi sitokin boyama için her tüpteki hücre süspansiyonuna her sitokin antikorunun iki mikrolitresini ekleyin. Tüpleri karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Yine, beş dakika boyunca 500 g'da santrifüj yapın ve daha önce gösterildiği gibi süpernatantı çıkarın.
Bir kez daha, hücreleri bir mililitre PBS'de yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 g'da santrifüj yapın ve süpernatantı daha önce gösterildiği gibi dikkatlice çıkarın. Ardından, hücreleri yeniden askıya almak için 500 mikrolitre PBS ekleyin.
PBMC örneğini tek başına izole ettikten sonra, daha önce gösterildiği gibi, hücre süspansiyonunu makalede açıklanan 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde 12 eşit parçaya bölün. Benzer şekilde, hücre yüzey belirteçlerini ve hücre içi sitokin antikorunu ekledikten sonra, daha önce gösterildiği gibi, hücreleri ve vorteksi düşük hızda yeniden askıya almak için 500 mikrolitre PBS ekleyin. Lekesiz bir numune kullanarak, ileri saçılımı, yan saçılımı ve farklı floresan boya voltajlarını ayarlarken, tek boyama numunelerini kullanarak farklı floroforlar arasındaki kontaminasyon sinyallerini ortadan kaldırmak için akış sitometrisi kompanzasyonunu ayarlayın.
Tek hücreleri seçmek için ileri dağılım alanı boyunca bir çokgen kapısı, bozulmamış lenfosit popülasyonunu seçmek için yan saçılma alanı nokta grafiği ve ileri saçılma alanı boyunca dikdörtgen bir kapı çizin, ileri saçılma genişliği nokta grafiği çizin. Ardından, canlı hücreleri seçmek için canlı, ölü taraf saçılma alanı nokta grafiği boyunca dikdörtgen bir kapı ve CD üç pozitif T hücresini tanımlamak için CD3 yan saçılma alanı nokta grafiğinden dikdörtgen bir kapı çizin. Ardından, CD4 pozitif veya CD8 pozitif T-hücrelerini tanımlamak için CD4, CD8 nokta grafiğinden ve CD4 pozitif veya CD8 pozitif T-hücrelerini TCM ve TEM'e alt bölümlere ayırmak için CD45RO, CD27 nokta grafiğinden dörtlü bir kapı çizin.
CD107a, interferon gama, tümör nekroz faktörü alfa, interlökin 2 ve mikrofaj inflamatuar protein bir alfa kapıları çizildikten sonra sırasıyla CD8 pozitif veya CD4 pozitif T-hücrelerinin TCM veya TEM'inden farklı yanıt paternlerinin sıklığını belirlemek için. Numuneleri sitometriye sırayla yükleyin. Geçit stratejisi, CD8 pozitif veya CD4 pozitif T hücrelerinin TCM veya TEM'ini ve bunların alt kümelerini ileri dağılım alanı genişliğini, ardından yan dağılım alanı nokta grafiğini kullanarak tanımlamak için kullanılmıştır.
JEV'e CD4 pozitif ve CD8 pozitif T-hücresi yanıtlarının polifonksiyonel karakterizasyonu, JEV stimülasyonundan sonra aşılanmış çocukların CD8 pozitif TCM hücrelerinde CD107a, interferon gama, tümör nekroz faktörü alfa ve interlökin 2 düzeylerinin aşılanmamış çocuklardakilere kıyasla arttığını göstermiştir. Bununla birlikte, makrofaj inflamatuar protein bir alfa seviyesi iki grup arasında farklılık göstermedi. JEV stimülasyonu altında aşılanmış grubun CD8 pozitif TEM hücrelerinde, aşılanmamış gruba kıyasla daha yüksek CD107a ve interferon gama seviyeleri tespit edildi.
Oysa tümör nekroz faktör alfa, interlökin 2 ve makrofaj inflamatuar protein bir alfa, bu pozitif hücrelerde anlamlı olarak yükselmedi. JEV antijeni, aşılanmış grubun CD4 pozitif TCM hücrelerinde aşılanmamış gruba kıyasla daha yüksek CD107a, interferon gama, tümör nekroz faktörü alfa ve makrofaj inflamatuar protein bir alfa seviyelerini başarıyla indükledi. Bununla birlikte, interlökin 2 pozitif hücrelerin oranı, JEV stimülasyonu altındaki iki grup arasında farklılık göstermedi.
Aşılanan grupta CD107a pozitif, interferon gama pozitif ve tümör nekroz faktörü alfa pozitif alt kümeleri, sub CD4 pozitif TEM hücrelerinin oranı, JEV varlığında aşılanmamış gruba göre daha yüksekti. Uyaranların T hücresi immünojenisitesi ve uyumlu renk eşleştirme stratejileri bu protokoldeki kritik adımlardır.
