O método de detecção e o esquema de cores da citometria de fluxo do TPFS específico do vírus da encefalite japonesa foram testados para fornecer uma referência para estudos semelhantes. A demonstração do procedimento será realizada por Linlin Zhang e Meng Zhang, dois alunos do nosso laboratório. Para começar, estimule os PBMCs do grupo de estimulação JEV com partículas concentradas inativadas de JEV por 16 horas a 37 graus Celsius na presença de anticorpos monoclonais, CD28 e CD49d, CD107a, GolgiPlug e monensina.
Em seguida, estimular os PBMCs do grupo controle sem partículas virais concentradas por 16 horas a 37 graus Celsius na presença de anticorpos monoclonais, CD28 e CD49d, CD 107a, GolgiPlug e monensina. Recolher a suspensão celular de cada grupo num tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Centrifugar a 500 g durante cinco minutos à temperatura ambiente e remover o sobrenadante com uma pipeta.
Ressuspenda as células em 1 mililitro de PBS. Adicione corante de viabilidade fixável à suspensão celular e incube por 10 minutos à temperatura ambiente no escuro. Centrifugar a 500 g à temperatura ambiente durante cinco minutos e remover o sobrenadante.
Depois de ressuspender as células em 1 mililitro de PBS, novamente, centrifugar a 500 g à temperatura ambiente por cinco minutos e descartar o sobrenadante como demonstrado anteriormente. Para realizar a coloração do marcador de superfície celular, ressuscite as células em 100 microlitros de PBS e adicione dois microlitros de cada anticorpo marcador de superfície à suspensão celular em cada tubo. Incubar os tubos durante 30 minutos à temperatura ambiente, protegendo-os da luz.
Centrifugar a 500 g durante cinco minutos e remover o sobrenadante como demonstrado anteriormente. Novamente, ressuspenda as células em um mililitro de PBS. Centrifugar a 500 g durante cinco minutos à temperatura ambiente e eliminar cuidadosamente o sobrenadante.
Para realizar a fixação e quebra da membrana, ressuspeite as células com 500 microlitros de solução fixadora que quebra a membrana e fixe as células por 20 minutos no escuro à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugar a 500 g durante cinco minutos e remover o sobrenadante. Depois de ressuspender as células em um mililitro de PBS, centrifugar por cinco minutos a 500 g à temperatura ambiente e remover o sobrenadante com cuidado, como demonstrado anteriormente.
Em seguida, ressuspenda as células em 100 microlitros de PBS e adicione dois microlitros de cada anticorpo de citocina à suspensão celular em cada tubo para coloração de citocinas intracelulares. Incubar os tubos por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Novamente, centrifugar a 500 g por cinco minutos e remover o sobrenadante como demonstrado anteriormente.
Mais uma vez, ressuspenda as células em um mililitro de PBS. Centrifugar a 500 g durante cinco minutos à temperatura ambiente e remover cuidadosamente o sobrenadante, tal como demonstrado anteriormente. Em seguida, adicione 500 microlitros de PBS para ressuspender as células.
Após o isolamento da amostra PBMC isoladamente, como demonstrado anteriormente, divida a suspensão celular em 12 partes iguais em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro descritos no manuscrito. Da mesma forma, após a adição dos marcadores de superfície celular e anticorpo de citocinas intracelulares, como demonstrado anteriormente, adicione 500 microlitros de PBS para ressuspender as células e o vórtice com baixa velocidade. Usando uma amostra não corada, ajuste o espalhamento para a frente, o espalhamento lateral e diferentes tensões de corante fluorescente, enquanto ajusta a compensação da citometria de fluxo para eliminar os sinais de contaminação entre os diferentes fluoróforos, usando as amostras de coloração única.
Desenhe um portão de polígono através da área de dispersão para a frente, gráfico de pontos da área de dispersão lateral para selecionar a população de linfócitos intacta, excluindo os detritos, e uma porta retangular através da área de dispersão para a frente, gráfico de pontos de largura de dispersão para a frente para selecionar as células únicas. Em seguida, desenhe um portão retangular através do gráfico de pontos de área de dispersão do lado morto e morto para selecionar as células vivas e um portão retangular através do gráfico de pontos da área de dispersão lateral CD3 para identificar o CD três células T positivas. Em seguida, desenhe uma porta quádrupla através do gráfico de pontos CD4, CD8 para identificar as células T CD4 positivas ou CD8 positivas e através do gráfico de pontos CD45RO, CD27 para subdividir as células T CD4 positivas ou CD8 positivas em MTC e TEM.
Depois de desenhar as portas de CD107a, interferon gama, fator de necrose tumoral alfa, interleucina 2 e micrófago proteína inflamatória um alfa do TCM ou MET das células T CD8 positivas ou CD4 positivas para determinar a frequência de diferentes padrões de resposta, respectivamente. Carregue as amostras na citometria sequencialmente. A estratégia de gating foi empregada para identificar o TCM ou MET de células T CD8 positivas ou CD4 positivas e seus subconjuntos usando a largura da área de dispersão para frente e, em seguida, o gráfico de pontos da área de dispersão lateral.
A caracterização polifuncional das respostas de células T CD4 positivas e CD8 positivas ao JEV indicou que níveis aumentados de CD107a, interferon gama, fator de necrose tumoral alfa e interleucina 2 foram detectados nas células TCM CD8 positivas das crianças vacinadas após estimulação JEV em comparação com aquelas em crianças não vacinadas. No entanto, o nível de macrófago inflamatório proteína um alfa não diferiu entre os dois grupos. Níveis mais elevados de CD107a e interferão gama foram detectados nas células TEM CD8 positivas do grupo vacinado sob estimulação JEV em comparação com o grupo não vacinado.
Considerando que o fator de necrose tumoral alfa, a interleucina 2 e a proteína inflamatória de macrófagos um alfa não foram significativamente elevados nessas células positivas. O antígeno JEV induziu com sucesso níveis mais elevados de CD107a, interferon gama, fator de necrose tumoral alfa e proteína inflamatória de macrófagos um alfa nas células TCM CD4 positivas do grupo vacinado em comparação com o grupo não vacinado. No entanto, a proporção de células positivas para interleucina 2 não diferiu entre os dois grupos sob estimulação JEV.
A proporção de células TEM CD107a positivas, interferon gama positivas e fator de necrose tumoral alfa positivas, sub-CD4 positivas no grupo vacinado foi maior na presença de JEV, do que no grupo não vacinado. A imunogenicidade das células T dos estímulos e as estratégias de correspondência de cores compatíveis são etapas críticas neste protocolo.
