Метод обнаружения и цветовая схема проточной цитометрии специфического для вируса японского энцефалита TPFS были протестированы, чтобы обеспечить ссылку для аналогичных исследований. Демонстрацию процедуры проведут Линьлинь Чжан и Мэн Чжан, два студента из нашей лаборатории. Для начала стимулируйте PBMCs группы стимуляции JEV концентрированными инактивированными частицами JEV в течение 16 часов при 37 градусах Цельсия в присутствии моноклональных антител, CD28 и CD49d, CD107a, GolgiPlug и моненсина.
Затем стимулируют PBMCs контрольной группы без концентрированных вирусных частиц в течение 16 часов при 37 градусах Цельсия в присутствии моноклональных антител, CD28 и CD49d, CD 107a, GolgiPlug и monensin. Соберите клеточную суспензию из каждой группы в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку. Центрифугу по 500 г в течение пяти минут при комнатной температуре, а супернатант удалить пипеткой.
Повторное суспендирование клеток в 1 миллилитре PBS. Добавьте в клеточную суспензию фиксируемый краситель жизнеспособности и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте. Центрифугировать по 500 г при комнатной температуре в течение пяти минут, а супернатант удалить.
После повторного использования клеток в 1 миллилитре PBS, опять же, центрифугируют при 500 г при комнатной температуре в течение пяти минут и выбрасывают супернатант, как показано ранее. Чтобы выполнить окрашивание маркером клеточной поверхности, повторно суспендируйте клетки в 100 микролитрах PBS и добавьте два микролитра каждого поверхностного маркерного антитела к клеточной суспензии в каждой трубке. Инкубируйте трубки в течение 30 минут при комнатной температуре, защищая их от света.
Центрифугировать при 500 г в течение пяти минут и удалить супернатант, как было показано ранее. Опять же, повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре PBS. Центрифугу по 500 г в течение пяти минут при комнатной температуре и осторожно выбросьте надосадочную массу.
Для выполнения фиксации и разрыва мембраны повторно суспендируют клетки 500 микролитрами мембраноразрушающего фиксирующего раствора и фиксируют клетки на 20 минут в темноте при комнатной температуре. Затем центрифугируют по 500 г в течение пяти минут и удаляют надосадочную кислоту. После повторного использования клеток в одном миллилитре PBS центрифугируют в течение пяти минут при 500 г при комнатной температуре и осторожно удаляют супернатант, как показано ранее.
Затем повторно суспендируют клетки в 100 микролитрах PBS и добавляют два микролитра каждого антитела к клеточной суспензии в каждой трубке для внутриклеточного окрашивания цитокинов. Инкубировать пробирки в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. Опять же, центрифугировать на 500 г в течение пяти минут и удалить супернатант, как было продемонстрировано ранее.
Еще раз, повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре PBS. Центрифугируйте при 500 г в течение пяти минут при комнатной температуре и осторожно удаляйте супернатант, как было показано ранее. Затем добавьте 500 микролитров PBS для повторного суспендирования клеток.
После выделения только образца PBMC, как было показано ранее, разделите клеточную суспензию на 12 равных частей в 1,5-миллилитровых микроцентрифужных трубках, описанных в рукописи. Аналогичным образом, после добавления маркеров клеточной поверхности и внутриклеточных цитокиновых антител, как было продемонстрировано ранее, добавляют 500 микролитров PBS для повторного суспендирования клеток и вихря с низкой скоростью. Используя незапятнанный образец, отрегулируйте прямое рассеяние, боковое рассеяние и различные напряжения флуоресцентного красителя, одновременно регулируя компенсацию проточной цитометрии для устранения сигналов загрязнения между различными флуорофорами, используя одиночные образцы окрашивания.
Нарисуйте полигональный затвор через прямую область рассеяния, точечный график боковой области рассеяния, чтобы выбрать неповрежденную популяцию лимфоцитов, исключая при этом мусор, и прямоугольный затвор через область прямого рассеяния, диаграмму ширины прямого рассеяния, чтобы выбрать отдельные клетки. Затем нарисуйте прямоугольный затвор через живой, мертвый точечный график области рассеяния, чтобы выбрать живые ячейки, и прямоугольный затвор через точечный график области рассеяния CD3, чтобы идентифицировать CD три положительные Т-клетки. Затем нарисуйте четырехугольник через CD4, CD8 точечный график для идентификации CD4-положительных или CD8-положительных Т-клеток и через CD45RO, CD27 точечный график, чтобы разделить CD4-положительные или CD8-положительные Т-клетки на TCM и TEM.
После рисования затворов CD107a, интерферона гамма, фактора некроза опухоли альфа, интерлейкина 2 и микрофагов воспалительного белка один альфа из ТКМ или ТЭМ CD8 положительных или CD4 положительных Т-клеток для определения частоты различных паттернов отклика соответственно. Загрузите образцы на цитометрию последовательно. Стратегия гастинга использовалась для идентификации ТКМ или ТЕА CD8-положительных или CD4-положительных Т-клеток и их подмножеств с использованием ширины прямой области рассеяния, а затем точечного графика области рассеяния бокового рассеяния.
Полифункциональная характеристика CD4-положительных и CD8-положительных Т-клеточных ответов на JEV показала, что повышенные уровни CD107a, интерферона гамма, фактора некроза опухоли альфа и интерлейкина 2 были обнаружены в CD8-положительных ТКМ-клетках вакцинированных детей после стимуляции JEV по сравнению с таковыми у невакцинированных детей. Однако уровень макрофагов воспалительного белка на одну альфа не различался между двумя группами. Более высокие уровни CD107a и интерферона гамма были обнаружены в CD8-положительных КЛЕТКАХ ТЕА вакцинированной группы при стимуляции JEV по сравнению с невакцинированной группой.
В то время как фактор некроза опухоли альфа, интерлейкин 2 и воспалительный белок макрофага один альфа, не были значительно повышены в этих положительных клетках. Антиген JEV успешно индуцировал более высокие уровни CD107a, интерферона гамма, фактора некроза опухоли альфа и воспалительного белка макрофагов один альфа в CD4-положительных ТКМ-клетках вакцинированной группы по сравнению с невакцинированной группой. Тем не менее, доля положительных клеток интерлейкина 2 не различалась между двумя группами при стимуляции JEV.
Доля CD107a положительных, интерферон гамма-положительных и альфа-положительных подмножеств фактора некроза опухоли, суб-CD4-положительных ТЭМ-клеток в вакцинированной группе была выше при наличии ЮВ, чем в невакцинированной группе. Иммуногенность стимулов Т-клеток и совместимые стратегии сопоставления цветов являются критическими шагами в этом протоколе.
