Gama ışınlaması, kolorektal kanser için yaygın olarak kullanılan bir tedavidir. Terapötik olarak etkili olmasına rağmen, gastrointestinal sistem üzerinde olumsuz etkileri vardır. Sunulan protokol, radyasyon hasarından sonra rejenerasyon sırasında hücrelerin aktivasyonunu, farklılaşmasını ve göçünü incelemek için etkili bir yöntem tanımlamaktadır.
Bu protokol, sağlam ve tekrarlanabilir bir radyasyon hasarı modelini tanımlar. Önemli olarak, bu model yaralanma sonrası bağırsak hücresi kaderini izlemeye izin verir ve böylece spesifik hücre alt popülasyonunun rejeneratif kapasitesinin daha iyi anlaşılmasını sağlar. Bu teknik, gerçek zamanlı davranışı ve yaralanma sonrası hücrelerin çeşitli alt popülasyonlarının etkileşimini incelemek için farklı soy izleme hayvan modellerini kullanabilir.
Bu protokoldeki küçük değişiklikler, radyasyon hasarı üzerine mikrobiyota ile farklı epitelyal, stromal ve immün hücre popülasyonları arasındaki ilişkilerin araştırılmasına izin vermelidir. Başlamak için, tamoksifen tozunu steril mısır yağında mikrolitre başına 30 mikrogramlık bir konsantrasyonda tekrar askıya alın. % 60 genlik ile 30 saniye açma-kapama döngülerinde üç dakika boyunca sonikasyon.
Oda sıcaklığında bir saat boyunca karanlıkta dönerek karıştırın. Ardından, EdU tozuna steril DMSO ekleyerek EdU'yu hazırlayın. Toplam hacmin 1 / 5'ini ekleyin ve kalan steril ultra saf su hacmini yavaşça ekleyin.
Tamamen çözündüğünde, aliquot ve 20 santigrat derecede saklayın. Sudaki %70 etanol, dört santigrat dereceye kadar soğutulmuş DPBS, Bouin'in fiksatif tamponu ve %10 tamponlu formalin gibi doku toplama ve fiksasyon için reaktifler hazırlayın. Daha sonra, bir fare diseksiyon kiti, Petri tabakları, 10 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 16 gauge gavage iğnesi ve histolojik kasetler gibi gerekli ekipmanı hazırlayın.
Gama ışınlamasına maruz kalmadan iki gün önce, deney hayvanlarını tamoksifen enjeksiyonu için hazırlayın. Her hayvanı tartın ve gerekli dozu hesaplayın. Karın bölgesini %70 etanol ile dezenfekte edin.
Daha sonra, Cre aracılı rekombinasyonu indüklemek için bir mililitrelik bir şırıngaya bağlı 27 gauge iğne kullanarak intraperitoneal olarak tek bir tamoksifen dozu uygulayın. Potansiyel tamoksifen toksisitesini dışlamak için önümüzdeki 48 saat boyunca hayvanları gözlemleyin. 48 saat sonra, hayvanları ışınlama odasına aktarın.
Gama ışınlayıcısındaki numune odasını %70 etanol çözeltisi ile dezenfekte edin. Emici paspası ve hayvanları numune odasının içine yerleştirin. Kapağı yerleştirin ve odayı kapatın.
Gama ışınlayıcısını, hayvanları 12 gri toplam vücut ışınlamasına maruz bırakacak şekilde programlayın. Ardından, anahtarı başlangıç konumuna getirin ve pozlamayı başlatmak için başlat tuşuna basın. Aktif pozlama süresi için odayı terk edin.
Önceden ayarlanmış süre geçtikten sonra, makine otomatik olarak durur ve bip sesi çıkarmaya başlar. Anahtarı durma konumuna getirerek makineyi kapatın. Numune haznesini açın ve kapağı çıkarın.
Hayvanları kafese aktarın ve numune odasını% 70 etanol ile dezenfekte edin. Hayvanları geleneksel barınma odasına geri aktarın ve tedavi sonrası durumlarını gözlemleyin. Hayvanların ağırlığını her gün izleyin.
Planlanan ötenaziden üç saat önce, karın bölgesini dezenfekte edin ve farelere 28 gauge insülin şırıngası kullanarak 100 mikrolitre EdU stok çözeltisi ile intraperitoneal olarak enjekte edin. Hayvanı ötenazi yaptıktan sonra, proksimal bağırsakları ışınlama sonrası farklı zaman noktalarında toplayın. İnce bağırsağın proksimal kısmını diseke edin ve bağlı dokuları çıkarın.
10 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 16 gauge düz besleme iğnesi kullanarak dokuyu soğuk DPBS ile yıkayın ve dokuyu Bouin'in fiksatif tamponu ile sabitleyin. Bağırsakları uzunlamasına kesin ve Swiss-roll tekniğini kullanarak proksimal bağırsakları yuvarlayın. Dokuları% 10 tamponlu formalin içeren bir kaba histolojik bir kaset içine yerleştirin ve oda sıcaklığında 24 ila 48 saat boyunca inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, histolojik kasetleri% 70 etanol'e aktarın ve dokuyu parafine gömün. Gömdükten sonra, histolojik kasetleri en az bir saat boyunca buzun üzerine yerleştirin. Ardından, bir mikrotom kullanarak beş mikron kalınlığında yatay bölümleri kesin.
Doku bölümlerini 45 santigrat dereceye kadar ısıtılmış bir su banyosuna aktarın ve bölümleri yüklü slaytlara yerleştirin. Slaytları kuruması için gece boyunca oda sıcaklığında bir rafta bırakın. İnce bağırsak örneklerinin hematoksilin ve eozin görüntüleri, sıfır saatte homeostatik bir bağırsak epiteli gösterdi ve bunu apoptotik faz sırasında kript bölmelerindeki hücrelerin kaybı izledi.
Bunu, yüksek proliferatif hücrelerin kriptleri doldurduğu ve yedinci güne kadar normalleşme aşamasına yol açan rejeneratif faz izledi. EYFP tarafından yapılan soy izlemesi, homeostaz sırasında, Bmi1 pozitif rezerv kök hücrelerinden kaynaklanan hücrelerin, kriptler içindeki artı dört ila artı altı pozisyonla sınırlı olduğunu göstermiştir. EdU ve Ki-67 boyaması, sahte ışınlanmış farelerde, aktif kök hücrelerden transit yükseltici bölgeye kadar uzanan normal bağırsak homeostazı gösterdi.
Apoptotik faz sırasında, radyasyon hasarının neden olduğu proliferatif hücrelerin kaybı ile birlikte EYFP-pozitif hücrelerin sayısı azaldı. Rejeneratif fazda, rezerv kök hücrelerin aktivasyonu ve Bmi1-pozitif hücrelerin hızlı proliferasyonu gözlendi. Daha fazla proliferasyon ve migrasyon bağırsak epitel bütünlüğünü yeniden sağladı.
TUNEL boyaması, homeostaz sırasında apoptotik hücrelerin bulunmadığını gösterdi. Apoptotik fazda geç dönemde TÜNEL boyamasında artış gözlendi. Rejeneratif faz sırasında, TUNEL boyaması, rejenere kriptler içinde istikrarlı bir şekilde azaldı ve kriptolar normalleştiğinde neredeyse hiç yoktu.
Bu teknik, yaralanma sonrası bağırsak rejenerasyonu sırasında spesifik hücre soylarının rolü hakkında daha derinlemesine bilgi toplamak için RNA dizileme, tek hücreli RNA dizileme, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama veya proteomik analiz ile birleştirilebilir. Araştırmacılar, bağırsak epitelinin rejeneratif kapasitesinin anlaşılmasını genişletmek için bağırsak rejenerasyonunda mikrobiyota ve epitelyal, stromal ve bağışıklık hücresi popülasyonları arasındaki etkileşimleri araştırabilirler.
