Die Gammabestrahlung ist eine weit verbreitete Behandlung von Darmkrebs. Und obwohl es therapeutisch wirksam ist, hat es negative Auswirkungen auf den Magen-Darm-Trakt. Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine effiziente Methode, um die Aktivierung, Differenzierung und Migration von Zellen während der Regeneration nach Strahlenschädigung zu untersuchen.
Dieses Protokoll beschreibt ein robustes und reproduzierbares Strahlenverletzungsmodell. Wichtig ist, dass dieses Modell es ermöglicht, das Schicksal von Darmzellen nach einer Verletzung zu verfolgen und somit ein besseres Verständnis der Regenerationsfähigkeit bestimmter Zellsubpopulationen zu ermöglichen. Diese Technik kann verschiedene Tiermodelle zur Verfolgung der Abstammungslinie verwenden, um das Echtzeitverhalten und die Interaktion verschiedener Subpopulationen von Zellen nach einer Verletzung zu untersuchen.
Geringfügige Änderungen an diesem Protokoll sollten es ermöglichen, die Beziehungen zwischen Mikrobiota und verschiedenen Epithel-, Stroma- und Immunzellpopulationen nach Strahlenschäden zu untersuchen. Resuspendieren Sie zunächst Tamoxifenpulver in sterilem Maisöl in einer Konzentration von 30 Mikrogramm pro Mikroliter. Beschallen Sie drei Minuten lang in 30-sekündigen Ein-Aus-Zyklen mit einer Amplitude von 60 %.
Eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln abwechselnd mischen. Bereiten Sie dann EdU vor, indem Sie dem EdU-Pulver steriles DMSO hinzufügen. Fügen Sie 1/5 des Gesamtvolumens hinzu und fügen Sie langsam das restliche Volumen des sterilen Reinstwassers hinzu.
Nach vollständiger Auflösung aliquotieren und bei 20 Grad Celsius lagern. Bereiten Sie Reagenzien für die Gewebeentnahme und -fixierung vor, z. B. 70 % Ethanol in Wasser, DPBS gekühlt auf vier Grad Celsius, Bouins Fixierpuffer und 10 % gepuffertes Formalin. Als nächstes bereiten Sie die notwendigen Geräte vor, wie z. B. ein Mäusepräparationsset, Petrischale, eine 16-Gauge-Sondennadel, die an einer 10-Milliliter-Spritze befestigt ist, und histologische Kassetten.
Bereiten Sie die Versuchstiere zwei Tage vor der Gammabestrahlung auf die Tamoxifen-Injektion vor. Wiegen Sie jedes Tier und berechnen Sie die erforderliche Dosierung. Desinfizieren Sie den Bauchbereich mit 70%Ethanol.
Verabreichen Sie dann eine Einzeldosis Tamoxifen intraperitoneal mit einer 27-Gauge-Nadel, die an einer Ein-Milliliter-Spritze befestigt ist, um eine Cre-vermittelte Rekombination zu induzieren. Beobachten Sie die Tiere in den nächsten 48 Stunden, um eine mögliche Tamoxifen-Toxizität auszuschließen. Nach 48 Stunden werden die Tiere in den Bestrahlungsraum gebracht.
Desinfizieren Sie die Probenkammer im Gammastrahler mit 70%iger Ethanollösung. Legen Sie die saugfähige Matte und die Tiere in die Probenkammer. Setzen Sie den Deckel auf und schließen Sie die Kammer.
Programmieren Sie den Gammastrahler so, dass die Tiere einer 12-grauen Ganzkörperbestrahlung ausgesetzt werden. Drehen Sie dann den Schlüssel in die Startposition und drücken Sie Start, um die Belichtung zu starten. Verlassen Sie den Raum für die aktive Belichtungszeit.
Nach Ablauf der voreingestellten Zeit stoppt das Gerät automatisch und beginnt zu piepen. Schalten Sie die Maschine aus, indem Sie den Schlüssel in die Stoppposition drehen. Öffnen Sie die Probenkammer und nehmen Sie den Deckel ab.
Setzen Sie die Tiere in den Käfig und desinfizieren Sie die Probenkammer mit 70%igem Ethanol. Bringen Sie die Tiere zurück in den konventionellen Stallraum und beobachten Sie ihren Zustand nach der Behandlung. Überwachen Sie täglich das Gewicht der Tiere.
Desinfizieren Sie drei Stunden vor der geplanten Euthanasie den Bauchbereich und injizieren Sie den Mäusen intraperitoneal 100 Mikroliter EdU-Stammlösung mit einer 28-Gauge-Insulinspritze. Nach dem Einschläfern des Tieres wird der proximale Darm zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Bestrahlung entnommen. Präparieren Sie den proximalen Teil des Dünndarms und entfernen Sie anhaftendes Gewebe.
Spülen Sie das Gewebe mit kaltem DPBS mit einer 16-Gauge-Nadel, die an einer 10-Milliliter-Spritze befestigt ist, und fixieren Sie das Gewebe mit Bouins Fixierpuffer. Schneiden Sie den Darm in Längsrichtung auf und rollen Sie den proximalen Darm mit der Swiss-Roll-Technik. Legen Sie das Gewebe in eine histologische Kassette in einen Behälter mit 10 % gepuffertem Formalin und inkubieren Sie es 24 bis 48 Stunden lang bei Raumtemperatur.
Nach der Inkubation werden die histologischen Kassetten auf 70%iges Ethanol übertragen und das Gewebe in Paraffin eingebettet. Legen Sie die histologischen Kassetten nach dem Einbetten für mindestens eine Stunde auf Eis. Schneiden Sie dann mit einem Mikrotom fünf Mikrometer dicke horizontale Abschnitte.
Übertragen Sie die Gewebeschnitte in ein auf 45 Grad Celsius erwärmtes Wasserbad und legen Sie die Schnitte auf geladene Objektträger. Lassen Sie die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Gestell trocknen. Hämatoxylin- und Eosinaufnahmen von Dünndarmproben zeigten ein homöostatisches Darmepithel zur Stunde Null, gefolgt vom Verlust von Zellen in Kryptenkompartimenten während der apoptotischen Phase.
Es folgte die regenerative Phase, in der hochproliferative Zellen die Krypten besiedelten, was zur Normalisierungsphase am siebten Tag führte. Die Linienverfolgung mittels EYFP zeigte, dass während der Homöostase die Zellen, die von Bmi1-positiven Reservestammzellen abstammten, auf die plus vier bis plus sechs Positionen innerhalb der Krypten beschränkt waren. Die EdU- und Ki-67-Färbung zeigte eine normale intestinale Homöostase in scheinbestrahlten Mäusen, die sich von aktiven Stammzellen bis in die transitamplifizierende Zone erstreckte.
Während der apoptotischen Phase nahm die Anzahl der EYFP-positiven Zellen ab, was mit einem Verlust proliferativer Zellen durch Strahlenschäden einherging. In der regenerativen Phase wurde eine Aktivierung von Reservestammzellen und eine schnelle Proliferation von Bmi1-positiven Zellen beobachtet. Weitere Proliferation und Migration stellten die Integrität des Darmepithels wieder her.
TUNEL-Färbungen zeigten, dass apoptotische Zellen während der Homöostase fehlen. Eine Zunahme der TUNEL-Färbung wurde spät in der apoptotischen Phase beobachtet. Während der Regenerationsphase nahm die TUNEL-Färbung in den regenerierenden Krypten stetig ab und war bei der Normalisierung der Krypten fast nicht mehr vorhanden.
Diese Technik kann mit RNA-Sequenzierung, Einzelzell-RNA-Sequenzierung, fluoreszenzaktivierter Zellsortierung oder Proteomanalyse kombiniert werden, um tiefere Erkenntnisse über die Rolle bestimmter Zelllinien bei der Darmregeneration nach Verletzungen zu gewinnen. Die Forschenden können die Wechselwirkungen zwischen Mikrobiota und Epithel-, Stroma- und Immunzellpopulationen bei der Darmregeneration untersuchen, um das Verständnis der Regenerationsfähigkeit des Darmepithels zu erweitern.
