감마선 조사는 대장암에 널리 사용되는 치료법입니다. 그리고 치료적으로 효과적이지만 위장관에 부정적인 영향을 미칩니다. 제시된 프로토콜은 방사선 손상 후 재생 동안 세포의 활성화, 분화 및 이동을 연구하는 효율적인 방법을 설명합니다.
이 프로토콜은 강력하고 재현 가능한 방사선 손상 모델을 설명합니다. 중요한 것은 이 모델을 통해 손상 후 장 세포의 운명을 추적할 수 있으므로 특정 세포 하위 집단의 재생 능력에 대한 더 나은 이해를 제공할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 뚜렷한 혈통 추적 동물 모델을 사용하여 손상 후 세포의 다양한 하위 집단의 실시간 행동과 상호 작용을 연구할 수 있습니다.
이 프로토콜에 대한 약간의 수정은 방사선 손상 시 미생물군과 다른 상피, 기질 및 면역 세포 집단 사이의 관계를 조사할 수 있도록 해야 합니다. 시작하려면 멸균 옥수수 기름에 타목시펜 분말을 마이크로 리터당 30 마이크로 그램의 농도로 재현 탁하십시오. 60 % 진폭으로 30 초 온-오프 사이클에서 3 분 동안 초음파 처리하십시오.
실온에서 1시간 동안 어둠 속에서 회전시켜 혼합한다. 그런 다음 EdU 분말에 멸균 DMSO를 첨가하여 EdU를 준비합니다. 총 부피의 1/5을 더하고 멸균 초순수의 나머지 부피를 천천히 첨가하십시오.
완전히 용해되면 분취하여 섭씨 20도에서 보관하십시오. 물 70% 에탄올, 섭씨 4도로 냉각된 DPBS, Bouin의 고정 완충액, 10% 완충 포르말린과 같은 조직 수집 및 고정용 시약을 준비합니다. 다음으로, 마우스 해부 키트, 페트리 접시, 10 밀리리터 주사기에 부착 된 16 게이지 위 관법 바늘 및 조직 학적 카세트와 같은 필요한 장비를 준비하십시오.
감마선 방사선 조사 노출 이틀 전에, 타목시펜 주사를 위해 실험동물을 준비한다. 각 동물의 무게를 측정하고 필요한 복용량을 계산하십시오. 복부를 70 % 에탄올로 소독하십시오.
그런 다음 1밀리리터 주사기에 부착된 27게이지 바늘을 사용하여 단일 용량의 타목시펜을 복강 내 투여하여 Cre 매개 재조합을 유도합니다. 잠재적인 타목시펜 독성을 배제하기 위해 다음 48시간 동안 동물을 관찰합니다. 48 시간 후, 동물을 방사선 조사실로 옮깁니다.
감마선 조사기의 샘플 챔버를 70% 에탄올 용액으로 소독합니다. 흡수 매트와 동물을 샘플 챔버 내부에 놓습니다. 뚜껑을 덮고 챔버를 닫습니다.
감마선 조사기를 프로그래밍하여 동물을 12개의 회색 전신 조사에 노출시킵니다. 그런 다음 키를 시작 위치로 돌리고 시작을 눌러 노출을 시작합니다. 활성 노출 시간 동안 방을 나가십시오.
미리 설정된 시간이 경과하면 기기가 자동으로 멈추고 신호음이 울리기 시작합니다. 키를 정지 위치로 돌려 기계를 끕니다. 샘플 챔버를 열고 뚜껑을 제거합니다.
동물을 케이지로 옮기고 샘플 챔버를 70% 에탄올로 소독합니다. 동물을 기존의 주거실로 다시 옮기고 치료 후 상태를 관찰합니다. 매일 동물의 체중을 모니터링하십시오.
계획된 안락사 3시간 전에 복부를 소독하고 28게이지 인슐린 주사기를 사용하여 100마이크로리터의 EdU 원액을 마우스에 복강 주사합니다. 동물을 안락사시킨 후, 방사선 조사 후 다른 시점에서 근위 내장을 수집하십시오. 소장의 근위 부분을 해부하고 부착 된 조직을 제거하십시오.
10밀리리터 주사기에 부착된 16게이지 직선 공급 바늘을 사용하여 차가운 DPBS로 조직을 세척하고 Bouin의 고정 완충액으로 조직을 고정합니다. 창자를 세로로 자르고 Swiss-roll 기술을 사용하여 근위 장을 굴립니다. 조직을 10% 완충된 포르말린이 있는 용기에 있는 조직학적 카세트에 넣고 실온에서 24-48시간 동안 배양합니다.
배양 후 조직학적 카세트를 70% 에탄올로 옮기고 조직을 파라핀에 삽입합니다. 포매 후 조직학적 카세트를 얼음 위에 최소 1시간 동안 놓습니다. 그런 다음 마이크로톰을 사용하여 5미크론 두께의 수평 단면을 자릅니다.
조직 절편을 섭씨 45도까지 예열 된 수조로 옮기고 절편을 충전 된 슬라이드에 놓습니다. 슬라이드를 실온에서 밤새 랙에 두어 건조시킵니다. 소장 표본의 헤마톡실린 및 에오신 이미지는 0시간에 항상성 장 상피를 보여주었고, 그 후 세포자멸사 단계 동안 지하실 구획 내의 세포가 손실되었습니다.
그 다음에는 증식성이 높은 세포가 선와를 채우는 재생 단계가 이어졌고, 7일째까지 정상화 단계로 이어졌습니다. EYFP에 의한 계통 추적은 항상성 동안 Bmi1 양성 예비 줄기 세포에서 유래 한 세포가 선와 내에서 플러스 4에서 플러스 6 위치로 제한되었음을 보여주었습니다. EdU 및 Ki-67 염색은 가짜 방사선 조사 마우스에서 정상적인 장 항상성을 보여주었으며, 활성 줄기 세포에서 통과 증폭 영역을 통해 확장되었습니다.
세포 사멸 단계에서 EYFP 양성 세포의 수가 감소하고 방사선 손상으로 인한 증식 세포의 손실이 동반되었습니다. 재생 단계에서는 예비 줄기 세포의 활성화와 Bmi1 양성 세포의 빠른 증식이 관찰되었습니다. 추가 증식과 이동은 장 상피 무결성을 회복했습니다.
TUNEL 염색은 항상성 동안 세포사멸 세포가 존재하지 않는다는 것을 보여주었다. TUNEL 염색의 증가는 세포사멸 단계 후반에 관찰되었다. 재생 단계에서 TUNEL 염색은 재생 크립트 내에서 꾸준히 감소했으며 크립트가 정상화되었을 때 거의 없었습니다.
이 기술은 RNA 염기서열 분석, 단일 세포 RNA 염기서열 분석, 형광 활성화 세포 분류 또는 단백질체 분석과 결합하여 손상 후 장 재생 중 특정 세포 계통의 역할에 대한 보다 심층적인 지식을 수집할 수 있습니다. 연구자들은 장 재생에서 미생물군과 상피, 기질 및 면역 세포 집단 간의 상호 작용을 조사하여 장 상피의 재생 능력에 대한 이해를 넓힐 수 있습니다.
