Kokleaya normal kan akışı, koklea Meniere Hastalığı için, özellikle saç hücrelerinin işlemi için gerekli itici güç olan iç mekan koklear potansiyelini korumak için kritik öneme sahiptir. Kan dolaşımının bu işlevi, farklı işitme kaybı biçimleriyle yakından ilişkilendirilmiştir. Koklear kan akımının daha iyi anlaşılması, kan akımı disfonksiyonundan kaynaklanan işitme bozukluklarının daha etkili bir şekilde yönetilmesini sağlayacaktır.
Bununla birlikte, doğrudan kan akımı ölçümü, iç kulağın değerlendirilmesinin zorluğu nedeniyle çok çok zordur. Koklear kan akışını değerlendirmek için teknikler şu anda hala geliştirilme aşamasındadır. Burada, fare gibi küçük hayvan türlerinde koklear kan akışını daraltmak için yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu ile konaklama birimlerinde laboratuarımızda kurulan son yöntemlerden birini açık kas penceresinde gösteriyoruz.
Bu tekniğin transgenetik kitle modelleri ile uygulanması, intravasküler riskte işitme fonksiyonu ile koklear kan akımı ile ilgili patoloji arasındaki bağlantıları çözmek için araştırmaları ilerletme potansiyeline sahiptir. Prosedürlerimiz dikkatli bir şekilde yürütülmelidir. Anlık vücut kanamasına ek olarak, kan basıncı ve kalp atışı da dahil olmak üzere hayvanın hayati belirtileri ameliyatınız sırasında izlenmelidir.
Kardiyak ponksiyon yoluyla heparinde yaklaşık bir milimetre kan toplayarak başlayın. Kanı dört santigrat derecede üç dakika boyunca 3000 kez G'de santrifüj edin. Plazmayı çıkarın, ardından kan hücresi peletini bir mililitre PBS ile üç kez 3000 kez G'de santrifüjleme yoluyla dört santigrat derecede üç dakika boyunca yıkayın.
Kan hücrelerini PBS'de bir mililitre 20 mikromolar DiO veya Dil ile etiketleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca karanlıkta inkübe edin. Etiketli kan hücrelerini bir mililitre PBS ile yıkayın ve üç dakika boyunca 3000 kez G'de üç kez santrifüj yapın. Enjeksiyondan önce hücre peletini yaklaşık 0.9 mililitre PBS ile% 30 hematokrit içinde yeniden askıya alın.
Steril cerrahi aletler ve görüntüleme platformu hazırlayın ve örtünün altına bir ısıtma yastığı yerleştirin. Anestezinin derinliğini kontrol etmek için anestezi uygulanan farelerin zayıf refleksini ve genel kas tonusunu izleyin. Kan basıncını ve kalp atışını izlemek için hayvanı sıcak ısıtma yastığına ve kuyruğunu monitör sistemine yerleştirin.
Rektal sıcaklığı 37 santigrat derecede tutun ve hayvanın sistolik kan basıncını, diyastolik kan basıncını ve anestezi altındaki durumda ortalama kan basıncını kaydedin. Sol timpanik bullayı stereo mikroskop altında lateral ve vental bir yaklaşımla açın ve timpanik membranı ve kemikçikleri sağlam bırakın. Hareketi en aza indirmek için hayvanın boynunun orta çizgisi boyunca, başı hareketsiz olacak şekilde bir kesi yapın.
Sol sub mandibuler bezi ve digastrik kasın arka göbeğini çıkarın ve koterize edin. Sternokleidomastoid kası ve bulla'ya doğru anterior uzanan fasiyal siniri tanımlayarak kemikli bullayı bulun ve ortaya çıkarın. Kemikli bullayı 30 gauge iğne ile açın ve yuvarlak pencere nişinin kenarında uzanan ve oval pencereye doğru ön üstünlüğe neden olan medial marjı ile koklear ve stapedial arterin net bir görünümünü sağlamak için çevredeki kemiği cerrahi cımbızla dikkatlice çıkarın.
Fare kokleasının tepe orta dönüşünde, ince bir nokta çatlayana kadar tepeden yaklaşık 1,25 milimetre uzaktaki yanal duvar kemiğini kazımak için küçük bir bıçak bıçağı kullanın. Kemik yongalarını küçük tel kancalarla çıkarın. Normal fizyolojik koşulları korumak ve damar görüntülerini kaydetmek için optik bir görünüm sağlamak üzere kap penceresini kesilmiş bir kapak kayması ile örtün.
Damarı açığa çıkarmak için sağ safen damar boyunca bir santimetrelik bir kesi yapın. FITC-Dextran çözeltisinin her birine 100 mikrolitre ve kan hücresi süspansiyonunu, kan damarlarının görselleştirilmesini ve kan akışının izlenmesini sağlamak için safen damarından hayvana art arda infüze edin. Enjeksiyondan beş dakika sonra bir video monitöründe kan akışını gerçek zamanlı olarak gözlemleyin.
Uzun bir çalışma mesafesi hedefi ve çoklu bant uyarma filtresi ve uyumlu emisyon filtresi içeren bir lamba muhafazası ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak kan damarlarını görüntüleyin. Video başına 350'den fazla görüntü elde eden yüksek çözünürlüklü dijital siyah beyaz şarj bağlantılı cihaz kamerasını kullanarak videoyu kaydedin. Akış hızının başarılı bir şekilde analiz edilmesini sağlamak.
Uygun yazılımı kullanarak kap çapını ölçün ve elde edilen görüntülerde gemi boyunca iki sabit nokta arasındaki mesafeyi belirleyin. Yazılımdaki kan akışı videosunu açın ve görüntülerin ölçeğini ayarlayın. İzleme işlevini kullanarak seçilen DiO lekeli kan hücrelerini izleyin.
Ardından, akış hızının otomatik olarak hesaplanması için hücrelerin hareket ettiği mesafeyi ve videodaki görüntü kareleri arasındaki zaman aralığını kullanın. Metin yazısında verilen denklemi kullanarak hacimsel akışı hesaplayın. Kan akışı kaydından önce gürültüye maruz kalma modelini oluşturmak için, hayvanları tel örgü kafeslere yerleştirin ve üç saat boyunca bir ses maruz kalma kabininde 120 desibel ses basıncı seviyesinde geniş bant gürültüsüne maruz bırakın.
Sonra ertesi gün üç saat daha. Gürültüye maruz kaldıktan iki hafta sonra kan akışını kaydedin. Lateral duvardaki koklear kılcal damarların cerrahi maruziyetinden sonra, FITC Dextran etiketli damarlardaki DiL etiketli kan hücrelerinin intravital yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobik gözlemi açık bir damar penceresinden gerçekleştirildi.
FITC Dextran ile etiketlenmiş Stria damarlarındaki DiL etiketli kan hücreleri burada gösterilmiştir. FITC Dextran ile etiketlenmiş Dio etiketli kan hücreleri, spiral ligamentin damar yoğunluğunun daha yoğun Stria vascularis'inkinden daha seyrek olduğunu göstermektedir. Yüksek çözünürlüklü IVM, kontrol ve gürültüye maruz kalan gruplardaki kan akış modellerini gösterir.
Gürültüye maruz kalan gruplarda bozulmuş kan dolaşımı paterni görülebilir. Anomaliler arasında damar çapının azalması ve damar çapının artması sayılabilir. Kontrol ve gürültüye maruz kalan gruplardaki kan akış hızları, DiO etiketli kan hücrelerinin kökleri izlenerek hesaplandı.
Gürültüye maruz kalan gruptaki kan hızı ve hacmi kontrol grubuna göre anlamlı derecede düşüktü. Açık damar penceresinin başarılı bir şekilde kurulması, yüksek derecede cerrahi beceri gerektirir. Koklear lateral duvarın kemiğinin çıkarılmasına özen gösterilmelidir.
