使用打开的血管窗口和活体荧光显微镜测量小鼠耳蜗中的心室血流

耳蜗的正常血液供应对耳蜗梅尼埃病至关重要，特别是对于维持室内耳蜗电位至关重要，这是毛细胞交易的基本驱动力。血液循环的这种功能与不同形式的听力损失密切相关。更好地了解耳蜗血流将有助于更有效地管理由血流功能障碍引起的听力障碍。

然而，由于难以评估内耳，直接血流测量非常具有挑战性。评估耳蜗血流的技术目前仍在开发中。在这里，我们展示了在我们的实验室中建立的最新方法之一 打开肌肉窗口 用高分辨率荧光显微镜缩小小鼠等小动物的耳蜗血流。

该技术在转基因质量模型中的应用有可能推进研究，以揭示听力功能与血管内风险中耳蜗血流相关的病理学之间的联系。我们的程序应谨慎进行。除了短暂的身体出血外，在手术过程中还必须监测动物的生命体征，包括血压和心跳。

首先通过心脏穿刺在肝素中收集约一毫米的血液。将血液在 3000 倍 G 下在 4 摄氏度下离心三分钟。取出血浆，然后用一毫升PBS洗涤血细胞沉淀三次，在4摄氏度下以3000倍G离心3分钟。

在PBS中用一毫升20微摩尔DiO或Dil标记血细胞，并在室温下在黑暗中孵育30分钟。用一毫升PBS洗涤标记的血细胞，并以3000倍G离心三次，持续三分钟。注射前将细胞沉淀重悬于30%血细胞比容中，用约0.9毫升PBS重悬。

准备无菌手术器械和成像平台，并在窗帘下方放置加热垫。监测麻醉小鼠的反射不良和一般肌肉张力，以检查麻醉深度。将动物放在温暖的加热垫上，并将其尾巴放在监测系统中，以监测血压和心跳。

将直肠温度保持在37摄氏度，并记录动物的收缩压，舒张压和麻醉状态下的平均血压。在体视显微镜下通过侧向和腹侧入路打开左侧鼓膜大疱，保持鼓膜和听小骨完整。沿着动物颈部的中线切开一个切口，头部固定以尽量减少运动。

切除左下颌下腺和二腹肌后腹部并烧灼。通过识别胸锁乳突肌和向前延伸至大疱的面神经来定位并暴露骨大疱。用 30 号针打开骨大疱，用手术镊子小心地去除周围的骨头，以提供耳蜗和镫骨动脉的清晰视野，其内侧边缘位于圆窗壁龛的边缘，使前上部朝向椭圆形窗口。

使用小刀刀片刮擦小鼠耳蜗顶端中转处的侧壁骨，距顶端约1.25毫米，直到出现一个细点破裂。用小铁丝钩取出骨屑。用切割盖玻片盖住容器窗口，以保持正常的生理条件，并为记录容器图像提供光学视图。

沿右隐静脉做一个一厘米的切口，露出血管。通过隐静脉将FITC-葡聚糖溶液和血细胞悬液各连续输注100微升到动物体内，以实现血管可视化和血流跟踪。注射后五分钟在视频监视器上实时观察血流。

使用配备长工作距离物镜和包含多波段激发滤光片和兼容发射滤光片的灯罩的荧光显微镜对血管进行成像。使用高分辨率数字黑白电荷耦合设备相机录制视频，每个视频可采集350多张图像。确保成功分析流速。

使用适当的软件测量容器直径，并确定采集图像中整个容器的两个固定点之间的距离。在软件中打开血流视频并设置图像的比例。使用跟踪功能跟踪选定的DiO染色血细胞。

然后使用单元格移动的距离和视频中图像帧之间的时间间隔来自动计算流速。使用文本手稿中给出的方程计算体积流量。要在血流记录之前创建噪声暴露模型，请将动物放在金属丝网笼中，并在声音暴露室中将它们暴露在120分贝声压级的宽带噪声中三个小时。

然后第二天再加三个小时。在噪音暴露两周后记录血流。在侧壁耳蜗毛细血管手术暴露后，通过打开的血管窗口对FITC葡聚糖标记血管中的DiL标记血细胞进行活体高分辨率荧光显微镜观察。

此处显示了用FITC葡聚糖标记的条纹血管中的DiL标记血细胞。用FITC葡聚糖标记的Dio标记的血细胞表明，螺旋韧带的血管密度比密度更大的血管纹更稀疏。高分辨率IVM显示了对照组和噪声暴露组的血流模式。

血液循环的紊乱模式可以在暴露在噪音的群体中看到。异常包括容器直径减小和容器直径变化增加。通过跟踪DiO标记血细胞的根部来计算对照组和噪声暴露组的血流速度。

噪声暴露组血流速度和血容量显著低于对照组。成功建立开血管窗需要高度的手术技巧。去除耳蜗侧壁的骨头时必须小心。