열린 혈관 창과 생체 내 형광 현미경을 사용한 마우스 달팽이관의 심방 혈류 측정

달팽이관으로의 정상적인 혈액 공급은 달팽이관 메니 에르 병, 특히 유모 세포 거래의 필수 원동력 인 실내 달팽이관 잠재력을 유지하는 데 매우 중요합니다. 이 혈액 순환 기능은 다양한 형태의 청력 손실과 밀접한 관련이 있습니다. 달팽이관 혈류를 더 잘 이해하면 혈류 기능 장애로 인한 청력 장애를 보다 효과적으로 관리할 수 있습니다.

그러나 직접적인 혈류 측정은 내이를 평가하기가 어렵 기 때문에 매우 어렵습니다. 인공와우 혈류를 평가하는 기술은 현재 개발 중입니다. 여기에서는 마우스와 같은 작은 동물 종의 달팽이관 혈류를 좁히기 위해 고해상도 형광 현미경으로 실험실의 열린 근육 창에서 확립 된 최근 방법 중 하나를 시연합니다.

이 기술을 전이유전학적 질량 모델에 적용하면 청력 기능과 혈관 내 위험에서 달팽이관 혈류와 관련된 병리학 사이의 연관성을 밝히기 위한 연구가 발전할 가능성이 있습니다. 우리의 절차는 신중하게 수행되어야합니다. 일시적인 신체 출혈 외에도 수술 중에 혈압 및 심장 박동을 포함한 동물의 활력 징후를 모니터링해야합니다.

심장 천자에 의해 헤파린에서 약 1 밀리미터의 혈액을 수집하는 것으로 시작하십시오. 섭씨 4도에서 3 분 동안 3000 배 G로 혈액을 원심 분리합니다. 혈장을 제거한 후, 혈액 세포 펠릿을 PBS 1 밀리리터로 섭씨 4도에서 3 분 동안 3000 배 G에서 3 회 원심 분리하여 3 회 세척한다.

PBS에서 20 마이크로 몰 DiO 또는 Dil의 1 밀리리터로 혈액 세포를 표지하고 실온에서 30 분 동안 어둠 속에서 배양합니다. 표지 된 혈액 세포를 PBS 1 밀리리터로 씻고 3000 배 G에서 3 분 동안 3 회 원심 분리합니다. 주사하기 전에 약 0.9 밀리리터의 PBS로 30 % 헤마토크릿에 세포 펠릿을 재현 탁하십시오.

멸균 수술 기구와 이미징 플랫폼을 준비하고 커튼 아래에 가열 패드를 놓습니다. 마취 된 마우스의 불량한 반사 및 일반적인 근육 톤을 모니터링하여 마취의 깊이를 확인하십시오. 동물을 따뜻한 가열 패드에 놓고 꼬리를 모니터 시스템에 두어 혈압과 심장 박동을 모니터링하십시오.

직장 온도를 섭씨 37도로 유지하고 마취 상태에서 동물의 수축기 혈압, 이완기 혈압 및 평균 혈압을 기록합니다. 실체 현미경으로 측면 및 복부 접근을 통해 왼쪽 고막 수포를 열어 고막과 이소골을 그대로 둡니다. 움직임을 최소화하기 위해 머리를 고정시킨 상태에서 동물의 목 정중선을 따라 절개하십시오.

왼쪽 하악선과 이위 근육의 후배를 제거하고 소작하십시오. 흉쇄 유돌근과 수포를 향해 앞쪽으로 뻗어 있는 안면 신경을 식별하여 뼈 수포를 찾아 노출시킵니다. 30 게이지 바늘로 뼈 수포를 열고 수술 용 핀셋으로 주변 뼈를 조심스럽게 제거하여 달팽이관 및 등골 동맥을 명확하게 볼 수 있도록 내측 여백이 둥근 창 틈새의 가장자리 위에 놓여 타원형 창쪽으로 앞쪽으로 상급합니다.

작은 칼날을 사용하여 얇은 반점이 갈라질 때까지 정점에서 약 1.25mm 떨어진 마우스 달팽이관의 정점 중간 회전에서 측벽 뼈를 긁어냅니다. 작은 와이어 후크로 뼈 조각을 제거하십시오. 정상적인 생리적 조건을 유지하고 혈관 이미지 기록을 위한 광학 보기를 제공하기 위해 절단 덮개 슬립으로 용기 창을 덮습니다.

혈관을 노출시키기 위해 오른쪽 복재 정맥을 따라 1cm 절개를하십시오. 복재 정맥을 통해 각각 100마이크로리터의 FITC-덱스트란 용액과 혈액 세포 현탁액을 동물에 연속적으로 주입하여 혈관을 시각화하고 혈류를 추적할 수 있습니다. 주사 후 5분 후에 비디오 모니터로 실시간으로 혈류를 관찰한다.

긴 작동 거리 대물렌즈와 다중 대역 여기 필터 및 호환 가능한 방출 필터가 포함된 램프 하우징이 장착된 형광 현미경을 사용하여 혈관을 이미지화합니다. 비디오 당 350 개 이상의 이미지를 획득하는 고해상도 디지털 흑백 충전 결합 장치 카메라를 사용하여 비디오를 녹화합니다. 유속의 성공적인 분석을 보장합니다.

적절한 소프트웨어를 사용하여 용기 직경을 측정하고 획득한 이미지에서 용기를 가로지르는 두 고정 지점 사이의 거리를 결정합니다. 소프트웨어에서 혈류 비디오를 열고 이미지의 크기를 설정합니다. 추적 기능을 사용하여 선택된 DiO 염색 혈액 세포를 추적합니다.

그런 다음 유속의 자동 계산을 위해 비디오가 이동한 거리와 이미지 프레임 사이의 시간 간격을 사용합니다. 텍스트 원고에 주어진 방정식을 사용하여 체적 흐름을 계산하십시오. 혈류 기록 전에 소음 노출 모델을 만들려면 동물을 철망 케이지에 넣고 소음 노출 부스에서 120 데시벨 음압 수준의 광대역 소음에 3 시간 동안 노출시킵니다.

그런 다음 다음날 추가로 3 시간 동안. 소음 노출 2 주 후 혈류를 기록하십시오. 측벽의 달팽이관 모세혈관의 외과적 노출 후, 열린 혈관 창을 통해 FITC 덱스트란 표지된 혈관에서 DiL 표지된 혈액 세포의 생체 내 고해상도 형광 현미경 관찰을 수행했습니다.

FITC 덱스트란으로 표지된 스트리아 혈관의 DiL 표지된 혈액 세포가 여기에 표시됩니다. FITC 덱스 트란으로 표지 된 Dio 표지 된 혈액 세포는 나선형 인대의 혈관 밀도가 밀도가 높은 선조 혈관보다 희박하다는 것을 보여줍니다. 고해상도 IVM은 대조군 및 소음 노출 그룹의 혈류 패턴을 보여줍니다.

혈액 순환의 방해 패턴은 소음 노출 그룹에서 볼 수 있습니다. 이상에는 용기 직경 감소와 용기 직경의 변동 증가가 포함되었습니다. 대조군 및 소음 노출 그룹의 혈류 속도는 DiO 표지된 혈액 세포의 뿌리를 추적하여 계산하였다.

소음 노출 그룹의 혈액 속도와 부피는 대조군보다 유의하게 낮았습니다. 열린 혈관 창을 성공적으로 설치하려면 높은 수준의 수술 기술이 필요합니다. 달팽이관 측벽의 뼈를 제거 할 때주의를 기울여야합니다.