Bu prosedür, ucuz ve yaygın olarak kullanılabilir araçları kullanarak yüksek kaliteli protein ve RNA elde etmek için ayrık dondurulmuş beyin bölgelerinin toplanmasını açıklar. Beyin bölgeleri diseksiyon yoluyla hasattan dondurulmuş tutulduğundan, hedef moleküller korunur ve araştırmacının ilgi çekici bölgeleri dikkatlice incelemek ve depolamak için zamanı vardır. İlgi çekici bölgelerin belirlenmesi başlangıçta zor olabilir.
Onlar ortaya çıktıve istenilen bölgelere göre bölümleri ile geri çekerken ortak beyin işaretleri kullanarak kimlik açık hale getirecektir. Ötenazi yetişkin CD-1 vahşi tip farelerden beyinleri çıkardıktan sonra, flaş sıvı nitrojen veya isopentane içinde 60 saniye boyunca doku dondurun. Kuru buz ile önceden soğutun ve eksi 80 santigrat derece saklayın.
Dokuyu incelemeden 24 saat önce, çözülmüş dondurucu paketleri yığınına temiz bir beyin matrisi yerleştirin. Ve iki dondurucu paketleri arasında matris kenarları sandviç jilet yuvalarının alt ve paketlerinin üst arasında yaklaşık yarım santimetre bırakmak emin olun. Üstten yaklaşık beş santimetreye kadar buz ile yalıtılmış bir kutu doldurarak diseksiyon için dondurulmuş bir cam plaka ayarlayın.
Sonra üstüne kuru buz 2,5 santimetrelik bir tabaka yerleştirin. Ve üzerini siyah plastik kaplamaile kapatın. Plastik üstüne bir cam plaka yerleştirin.
Ve tabağın sınırları etrafında kuru buz. Donmuş beyin matrisini dondurucudan çıkarın ve beyni, korteks tarafını matrisin içine yerleştirin. Doku 10 dakika boyunca kutusunda sıcaklık için dengelemek için izin verin.
Bu süre zarfında kapağı açık tutmak. Sagittal sinüs ve enine sinüs bloğun dik oluklar ile hizaya böylece matris beynin konumunu ayarlamak için soğuk forceps kullanın. Beyin yerle bir olduktan sonra, ortasına soğuk bir jilet yerleştirin ve dokuiçine yaklaşık bir milimetre bastırın.
Sonra, beynin her iki ucuna bir soğutulmuş bıçak yerleştirin ve matris içine tüm yol basın. Daha sonra rostral ucunda soğutulmuş bıçaklar ekleyerek başlar, yuvaları içine birer birer yerleştirerek ve yavaşça doku içine bir milimetre basarak. Bir milimetre aralıklarla bıçak eklemeye devam edin, kaudal sonuna doğru çalışarak.
Tüm bıçaklar yerinde olduğunda, parmakları, avuç içi veya kör bir nesne ile üst aşağı basın ve doku ile hareket etmek için yan yana yavaşça onları kaya. Bıçaklar yuvaların dibine ulaştıktan sonra, bıçak grubunun her iki tarafını da kavrayın ve ileri geri sallayarak matristen kurtarın. Bıçakgrubu serbest bıraktıktan sonra cam plaka üzerine rostral tarafı yerleştirin ve daha kolay ayırma için örnekleri daha fazla dondurmak için yığının yanına veya üstüne kuru buz koyun.
Daha sonra desteyi keskin kenarlı yerleştirin ve desteyi başparmak ile parmaklar arasında kaydırarak bıçakları ayırın. Cam plakalar üzerindeki bölümü rostral'den kaudal'a kadar hizalayın ve parmakların arasına esnederek veya ikinci bir soğutulmuş bıçakla ayırarak dokuyu bıçaklardan ayırın. Bazen, doku bir bıçağın her iki tarafına yapışabilir ve kaudal oryantasyona rostral korumak için dikkatli olunmalıdır.
Diseksiyonu başlatmadan önce, Allen Mouse Beyin Atlası'nı veya başka bir referansı açın ve ilgi çekici bölgeleri belirlemek için gerekli olan simgeleri bulun. Bölümü çevirmek için soğutulmuş çterler veya bıçaklar kullanın. Ve ilgi bölgesi bölüm boyunca tutarlı olduğundan emin olun.
Temiz bir neşter veya yumruk ile bölüme kesin, yavaşça ama sıkıca doku içine metal iterek. Kesmek için ileri geri sallıyor. İlgi alanı hasat edildikten sonra, önceden soğutulmuş 1,5 milimetrelik tüplerin içine yerleştirin ve eksi 80 santigrat derece de saklayın.
Dokuyu işlemek için, protein ekstraksiyonu için soğuk RIPA tamponu veya RNA ekstraksiyonu için çözücü içeren guanidinium ekleyin ve hemen bir cam inme veya mekanik homogenizer ile homojenize edin. Bu yöntemi doğrulamak için medial prefrontal korteks erişkin CD-1 yabani tip erkek farelerden toplanmış ve RNA ve protein karakterize edilmiştir. Kapiller elektroforez ile analiz edildiğinde, bozulmuş RNA 28S ve 18S ribozomal bantların yoğunluğunda bir kayıp ve 25 ila 200 nükleotit arasında bir yayma görüntüler.
Yüksek kaliteli RNA, düşük molekül ağırlıklı bölgede sinyal vermek için çok az farklı ribozomal bantlar gösterirken. Dondurulmuş diseksiyon yöntemi kullanılarak elde edilen RNA, taze hasat edilen dokudan hazırlanan RNA ile karşılaştırıldı. Her iki yöntem de yüksek bütünlük numaraları ve güçlü ribozomal bantlama ile RNA üretmek.
Bu yöntemin daha sonra analiz için diseksiyonlu dokunun mikro ortamını korumak için kullanılabileceğini doğrulamak için, RNA birkaç hafta boyunca depolanan diseksiyonlu medial prefrontal korteksten çıkarıldı. Tüm numuneler, farklı ribozomal bantlama ve RNA bütünlüğü sayıları sekizin üzerinde olan yüksek kaliteli RNA üretti. Dondurulmuş parçalanmış örneklerin protein bütünlüğünü doğrulamak için, protein toplandı, nitroselüloz transfer ve yüksek molekül ağırlıklı hedef KCC2 karşı antikor ile prob, ve düşük molekül ağırlıklı protein aktin.
Her durumda bantları keskin ve belirgin hiçbir fark arıza ürünleri ile edildi. Bu bölümlerin mikroortamını korur ve beyin atlası görüntüleri ile karşılaştırıldığında kesit morfolojisi korumak gibi süreç boyunca dokuları dondurulmuş tutmak önemlidir. Bu şekilde toplanan ilgi bölgeleri negatif 80 derece santigrat birkaç ay saklanabilir ve RT-qPCR, RNA-Seq, Batı leke analizi ve HPLC dahil olmak üzere birçok downstream uygulamalarda kullanılabilir.
Bu yöntem, bu ilaçların beyin gelişimini nasıl etkileyebileceğini daha iyi anlamak için THC ve diğer kannabinoidlere maruz kalan perinatal kemirgenlerin limbik sistemlerindeki moleküler değişiklikleri araştırmak için kullanılmıştır.
