يصف هذا الإجراء مجموعة من مناطق الدماغ المجمدة منفصلة للحصول على البروتين عالي الجودة وRNA باستخدام أدوات غير مكلفة ومتاحة عادة. لأن مناطق الدماغ يتم الاحتفاظ المجمدة من الحصاد من خلال تشريح، يتم الحفاظ على الجزيئات المستهدفة والباحث لديه الوقت لتشريح بعناية وتخزين المناطق ذات الأهمية. تحديد المناطق ذات الأهمية يمكن أن يكون في البداية تحديا.
استخدام معالم الدماغ المشتركة لأنها تظهر وتنحسر من خلال أقسام فيما يتعلق المناطق المطلوبة سيجعل تحديد واضح. بعد إزالة العقول من القتل الرحيم الكبار CD-1 الفئران البرية نوع، فلاش تجميد الأنسجة لمدة 60 ثانية في أي من النيتروجين السائل أو إيسوبينتان. قبل البرد مع الثلج الجاف وتخزينه في ناقص 80 درجة مئوية.
قبل 24 ساعة من تشريح الأنسجة، ضع مصفوفة الدماغ النظيفة على كومة من حزم الفريزر المذابة. وساندويتش الجانبين إلى المصفوفة بين اثنين من حزم الفريزر التأكد من ترك ما يقرب من نصف سنتيمتر بين الجزء السفلي من فتحات الحلاقة والجزء العلوي من حزم. إعداد لوحة زجاجية مجمدة للتشريح عن طريق ملء مربع معزول مع الجليد تصل إلى ما يقرب من خمسة سنتيمترات من أعلى.
ثم ضع طبقة 2.5 سنتيمتر من الجليد الجاف على القمة. واغطيها بأغطية بلاستيكية سوداء. ضع لوحة زجاجية فوق البلاستيك.
و الثلج الجاف حول حدود الصحن إزالة مصفوفة الدماغ المجمدة من الفريزر وإدراج الدماغ، الجانب القشرة حتى، في المصفوفة. السماح للأنسجة لتكواسير إلى درجة الحرارة في منطقة الجزاء لمدة 10 دقائق.
إبقاء الغطاء مفتوحاً خلال هذا الوقت. استخدام ملقط الباردة لضبط موقف الدماغ في المصفوفة بحيث جيب القوس والجيوب الأنفية العرضية خط يصل مع الأخادل عمودي من الكتلة. بمجرد أن يكون الدماغ في موضعه، ضع شفرة حلاقة مبردة بالقرب من مركزه واضغط عليه حوالي ملليمتر واحد في الأنسجة.
بعد ذلك، ضع شفرة مبردة واحدة في كل نهاية من الدماغ واضغط على طول الطريق إلى أسفل إلى المصفوفة. ثم ابدأ في إضافة شفرات مبردة في النهاية الرسترالية ، ووضعها في فتحات واحدة في وقت واحد والضغط عليها بلطف ملليمتر واحد في الأنسجة. استمر في إضافة شفرات على فترات ملليمتر واحد، والعمل باتجاه نهاية الضم.
عندما تكون جميع الشفرات في مكانها، اضغط لأسفل على أعلى مع الأصابع، والنخيل، أو كائن حاد وروك لهم ببطء من جانب إلى آخر لنقلها من خلال الأنسجة. بمجرد أن وصلت الشفرات إلى الجزء السفلي من الفتحات ، فهم كل جانب من مجموعة الشفرات وتحريرها من المصفوفة عن طريق هزاز ذهابا وإيابا. بعد تحرير مجموعة من ريش وضعها الجانب التاجي حتى على لوحة الزجاج، ووضع الجليد الجاف بجانب أو على رأس المكدس لتجميد مزيد من العينات لفصل أسهل.
ثم ضع المكدس مع حواف حادة لأسفل وقم بفصل الشفرات عن طريق تحويل المكدس بين الإبهام والأصابع. صف القسم على اللوحات الزجاجية من الستراتل إلى السد وفصل الأنسجة عن الشفرات عن طريق ثنيها بين الأصابع ، أو عن طريق فصلها بشفرة مبردة ثانية. في بعض الأحيان، قد تلتصق الأنسجة على جانبي الشفرة ويجب توخي الحذر للحفاظ على الاتجاه التاجي إلى السد.
قبل البدء في تشريح، فتح أطلس الدماغ الماوس ألن أو مرجع آخر والعثور على المعالم اللازمة لتحديد المناطق ذات الأهمية. استخدام ملقط أو شفرات مبردة لقلب القسم. وتأكد من أن المنطقة ذات الاهتمام متسقة في جميع أنحاء القسم.
مقطعة إلى القسم مع مشرط نظيفة أو لكمة، ودفع المعدن بلطف ولكن بحزم في الأنسجة. هزاز عليه ذهابا وإيابا لجعل خفض. بعد حصاد المنطقة ذات الاهتمام، ضعها في أنابيب 1.5 ملليمتر مُبرَّدة مسبقًا ومُرّدة مسبقًا، ثم قم بتخزينها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية.
لمعالجة الأنسجة، إضافة الباردة RIPA العازلة لاستخراج البروتين أو guanidinium تحتوي على مذيب لاستخراج الحمض النووي الريبي وعلى الفور التجانس مع انخفاض الزجاج أو التجانس الميكانيكية. للتحقق من صحة هذه الطريقة، تم جمع قشرة الفص الجبهي من الفئران الذكور من النوع البري البالغ CD-1، وتم توصيف الحمض النووي الريبي والبروتين. عندما تحليلها مع الكهرباء الشعرية، يظهر الحمض النووي الريبي المتدهورة فقدان في شدة 28S و 18S عصابات الريبوسوم، فضلا عن مسحة بين 25 و 200 نيوكليوتيدات.
بينما يظهر الحمض النووي الريبي عالي الجودة نطاقات الريبوسومية المتميزة إشارة قليلة أو معدومة في منطقة الوزن الجزيئي السفلي. تم مقارنة الحصول على الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة التشريح المجمدة مع الحمض النووي الريبي المعدة من الأنسجة الطازجة. كلا طريقتين إنتاج الجيش الملكي النيبالي مع أعداد عالية من النزاهة و النطاقات الريبوسومية قوية.
للتأكد من أن هذه الطريقة يمكن استخدامها للحفاظ على البيئة الدقيقة للأنسجة تشريح لتحليلها في وقت لاحق، تم استخراج الحمض النووي الريبي من قشرة الفص الجبهي المُنَحَث الذي تم تخزينه على مدى عدة أسابيع. أنتجت جميع العينات RNA عالية الجودة مع نطاقات ريبوزومية متميزة وأرقام سلامة الحمض النووي الريبي فوق ثمانية. لتأكيد سلامة البروتين من العينات تشريح المجمدة، تم جمع البروتين، ونقلها إلى نيتروسيلولوز والتحقيق مع الأجسام المضادة ضد الهدف الوزن الجزيئي العالي KCC2، وانخفاض الوزن الجزيئي البروتين actin.
وفي جميع الحالات كانت النطاقات حادة ومتميزة دون منتجات انهيار ملحوظة. من المهم الحفاظ على الأنسجة المجمدة طوال العملية لأن هذا يحافظ على البيئة الدقيقة للأقسام والحفاظ على مورفولوجيا القسم للمقارنة مع صور أطلس الدماغ. ويمكن تخزين المناطق ذات الاهتمام التي يتم جمعها بهذه الطريقة لعدة أشهر في درجة مئوية سالبة 80 ويمكن استخدامها في العديد من التطبيقات المصب، بما في ذلك RT-qPCR، RNA-SEQ، وتحليل البقع الغربية، و HPLC.
وقد استخدمت هذه الطريقة لاستكشاف التغيرات الجزيئية داخل النظم الحوفية من القوارض في الفترة المحيطة بالولادة المعرضة لTHC وغيرها من القنب لفهم أفضل كيف يمكن لهذه الأدوية أن تؤثر على نمو الدماغ.
