Este procedimento descreve a coleção de regiões cerebrais congeladas discretas para obter proteínas de alta qualidade e RNA usando ferramentas baratas e comumente disponíveis. Como as regiões cerebrais são mantidas congeladas da colheita através da dissecção, as moléculas-alvo são preservadas e o pesquisador tem tempo para dissecar cuidadosamente e armazenar regiões de interesse. Identificar regiões de interesse pode inicialmente ser um desafio.
O uso de marcos cerebrais comuns à medida que emergem e recuam através das seções em relação às regiões desejadas, deixará a identificação clara. Depois de remover cérebros de camundongos adultos de CD-1, o flash congela o tecido por 60 segundos em nitrogênio líquido ou isopentane. Pré-frio com gelo seco e armazene-o a menos 80 graus Celsius.
24 horas antes de dissecar o tecido, coloque uma matriz cerebral limpa em uma pilha de embalagens de congelador descongeladas. E sanduiche as laterais para a matriz entre dois pacotes de congelador certificando-se de deixar aproximadamente meio centímetro entre a parte inferior das ranhuras de barbear e a parte superior das embalagens. Configure uma placa de vidro congelada para a dissecção preenchendo uma caixa isolada com gelo até aproximadamente cinco centímetros do topo.
Em seguida, coloque uma camada de 2,5 centímetros de gelo seco em cima. E cubra com lençóis plásticos pretos. Coloque uma placa de vidro em cima do plástico.
E gelo seco ao redor das fronteiras da placa. Remova a matriz cerebral congelada do congelador e insira o cérebro, lado do córtex para cima, na matriz. Deixe o tecido equilibrar à temperatura da caixa por 10 minutos.
Mantendo a tampa aberta durante este tempo. Use fórceps frios para ajustar a posição do cérebro na matriz para que o seio sagital e o seio transversal se alinhem com as ranhuras perpendiculares do bloco. Uma vez que o cérebro esteja em posição, coloque uma lâmina de barbear gelada perto de seu centro e pressione-a aproximadamente um milímetro no tecido.
Em seguida, coloque uma lâmina gelada em cada extremidade do cérebro e pressione todo o caminho até a matriz. Em seguida, comece a adicionar lâminas geladas na extremidade rostral, colocando-as nas ranhuras uma de cada vez e pressionando-as suavemente um milímetro no tecido. Continue adicionando lâminas em intervalos de um milímetro, trabalhando em direção ao final caudal.
Quando todas as lâminas estiverem no lugar, pressione para baixo em cima com os dedos, palma ou um objeto contundente e balance-as lentamente de um lado para o outro para movê-las através do tecido. Uma vez que as lâminas tenham atingido a parte inferior das ranhuras, segure cada lado do grupo de lâminas e liberte-as da matriz balançando para frente e para trás. Depois de liberar o grupo de lâminas coloque-os rostral lado para cima na placa de vidro, e coloque gelo seco ao lado ou em cima da pilha para congelar ainda mais as amostras para facilitar a separação.
Em seguida, coloque a pilha com bordas afiadas para baixo e separe as lâminas deslocando a pilha entre o polegar e os dedos. Forque a seção das placas de vidro do rostral ao caudal e separe o tecido das lâminas flexionando-os entre os dedos, ou separando-os com uma segunda lâmina gelada. Às vezes, o tecido pode grudar em ambos os lados de uma lâmina e deve-se tomar cuidado para manter rostral à orientação caudal.
Antes de iniciar a dissecção, abra o Allen Mouse Brain Atlas ou outra referência e encontre os marcos necessários para identificar regiões de interesse. Use fórceps ou lâminas geladas para virar a seção. E certifique-se de que a região de interesse seja consistente em toda a seção.
Corte na seção com um bisturi limpo ou um soco, empurrando o metal suavemente, mas firmemente no tecido. Balançando para frente e para trás para fazer o corte. Depois de colher a região de interesse, coloque-a em tubos de 1,5 milímetros pré-refrigerados e armazene-os a menos 80 graus Celsius.
Para processar o tecido, adicione tampão RIPA frio para extração de proteínas ou um guanidinium contendo solvente para extração de RNA e homogeneize-o imediatamente com uma queda de vidro ou homogeneizador mecânico. Para validar esse método, o córtex pré-frontal medial foi coletado de camundongos machos adultos do tipo CD-1, e o RNA e a proteína foram caracterizados. Quando analisado com eletroforese capilar, o RNA degradado apresenta uma perda na intensidade das bandas ribossômicas 28S e 18S, bem como uma mancha entre 25 e 200 nucleotídeos.
Enquanto o RNA de alta qualidade mostra bandas ribossômicas distintas pouco ou nenhum sinal na região de menor peso molecular. O RNA obtido utilizando o método de dissecção congelado foi comparado com o RNA preparado a partir de tecido recém-colhido. Ambos os métodos produzem RNA com altos números de integridade e forte banda ribossômica.
Para confirmar que este método pode ser usado para preservar o microambiente do tecido dissecado para análise posterior, o RNA foi extraído do córtex pré-frontal medial dissecado que havia sido armazenado ao longo de várias semanas. Todas as amostras produziram RNA de alta qualidade com distintas faixas ribossômicas e números de integridade de RNA acima de oito. Para confirmar a integridade proteica das amostras dissecadas congeladas, a proteína foi coletada, transferida para nitrocelulose e sonda com anticorpo contra o alvo de alto peso molecular KCC2, e a actina de proteína de menor peso molecular.
Em todos os casos, as bandas eram nítidas e distintas, sem produtos de decomposição perceptíveis. É importante manter os tecidos congelados durante todo o processo, pois isso preserva o microambiente das seções e manter a morfologia da seção para comparação com as imagens do atlas cerebral. As regiões de interesse coletadas dessa forma podem ser armazenadas por vários meses a 80 graus Celsius negativos e podem ser utilizadas em muitas aplicações a jusante, incluindo RT-qPCR, RNA-Seq, western blot analysis e HPLC.
Este método tem sido usado para explorar alterações moleculares dentro dos sistemas límbicos de roedores perinatais expostos ao THC e outros canabinóides para entender melhor como essas drogas podem afetar o desenvolvimento cerebral.
