Name: stereotactic atlas-guided laser capture microdissection of brain regions affected by traumatic injury
Uploaded: 2017-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury at JoVE.com

Elizabeth Sumner bu el yazması düzenleme onun yardımını kabul etmek istiyoruz. Bu proje için finansman kısmen Moody Project tarafından translasyonel travmatik beyin hasarı araştırma ve RO1NS052532 için HLH için sağlandı.

Not: Bütün hayvan deneyleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Texas Tıp Şubesi, Galveston, Texas Üniversitesi tarafından Ulusal Sağlık Rehberi Enstitüleri tarafından bakımı ve kullanımı için yönetmen olarak onaylanır Laboratuvar hayvanlarının (8 Edition, Ulusal Araştırma Konseyi).
 1. doku toplanması, bölge kimliği ve Sectioning <ol><li>Konu yetişkin, erkek, Sprague-Dawley Rat, yaklaşık altı haftalık ve 250-300 g, deneysel sıvı perküsyon yaralanma, Shimamura ve ark içinde açıklandığı gibi. 4.</li> <li>24 saat sonra deneysel Tby, insanca ötenazi hayvanlar bir isoflurane konsantrasyon derin anestezi kadar % 4 ile bir odaya yerleştirerek. Ölüm tarafından işten çıkarma sağlamak, beyin tüketim ve hemen toz kuru buzun içinde dondurma. -80 ° C dondurucu beyinlerinde kesit kadar donmuş mağaza.</li>
	<li>Önceden transkripsiyon analizi, içerir LCM yordami için kirlenme ve RNA bozulması riskini azaltmak için deterjan ortadan kaldırarak RNase ile tüm yüzeyler temiz. 
	Not: Bu temizliğin, nerede doku kesitli, cryostat boyama için kullanılan alan ve LCM aygıt çevresini içerir.</li>
	<li>Beyin dokusu içine bir cryostat-20-soğutmalı Muhafazası ve yer almak ° c ~ 10 dakika süreyle cryostat Oda sıcaklığı için equilibrate için izin ver beyin</li>
	<li>Cryostat sahne üzerine gazlı bez sayfadaki kadar beyin ventral yanına koyun. Bir temiz, RNase free tıraş bıçağı ile arka bölümü için beyincik sadece rostral kesmek (kaydedilen atılır veya) ve optik hemisferlerine (och) anterior bölümü.</li>
	<li>En uygun kesme sıcaklık (OCT) orta küçük bir miktar iki ayrı cryomolds yerleştirin. (Ön Birliği korteks (FrA) ve nucleus accumbens çekirdek (AcbC) cryomolds ön tarafı aşağı içeren) beyin yerleştirin. Doku karşılamak için yeterli OCT orta ekleyin.
	<ol><li>Beyin dokusu Hipokampus (Hp) ve suprachiasmatic çekirdeği (SCN) içeren bu işlemi tekrarlayın.</li>
		<li>Tamamen cryostat ~ 20 min için dondurmak OCT orta izin.</li>
	</ol></li> <li>Bu doku ve OCT orta tamamen donmuş bir kez küçük bir miktar, Ekim bir montaj kafa sıkmak ve montaj baş üzerine doku içeren dondurulmuş cryomolds tuşuna basın. OKT'yi şekilde tamamen dondurma doku içeren kalıp başından sıkıca takılı izin.</li>
	<li>Baş ek parça montaj için güvenli ve vidasını sıkın. Cryostat bıçak ile ilgili olarak kesme açısı bölümleri kesilir eşit emin olmak için ayarlama kolları ile ayarlamak.</li>
	<li>Bölüm kalınlığı 30 µm için ayarlayın. FrA ve AcbC içeren doku blok kesit, ilk beyin korteksi belirgin olana kesit ve sonra başlangıç toplama başlar.</li>
	Yavaşça oda sıcaklığında polietilen napthalate (kalem) membran slaytlar kesitli doku üstüne FrA için ikincil motor korteks (M2 kadar yanında duvar ilanı başvuru sıçan beyin Atlas 12, bölüm ve toplamak beyin <li>bölümleri ) Bregma 5,16 mm ulaştı.
	<ol><li>Görsel olarak bağlılık doku ve OCT tamamen slayt erimiş Eğer inceleyerek slayt sağlamak. Boyama kadar cryostat doku bölümleri ile tüm slaytları depolama.</li>
	</ol></li> <li>Kadar anterior komissür (aca) görünür hale gelir ve Bregma 1,80 mm şimdi belirgin lateral ventrikül (LV) altında bir tam komissür içine birleştiren kesit devam.</li>
	<li>Toplama simgeler LVs kadar aca Bregma yönü ile bağlanmak için 0.84 mm.</li>
	<li>FrA ve AcbC için kesit tamamlandıktan sonra bağlı doku blok kaldırmak ve HP ve SCN (sahne) içeren blok ile değiştirin.</li>
	<li>Üçüncü ventrikül (3V) belirgin hale geldiğinde och-0.48 mm, Bregma düzleştirilir kadar bölüm.</li>
	<li>Toplamak bölümleri için bu noktadan Bregma kadar-0.72 supraoptic decussation (sox) başladığında mm, SCN (sahne). 
	Not: SCN kolayca üzerinden geçti gibi daha fazla doku bölümleri och boyunca toplamak gerekli olabilir.</li>
	<li>HP koleksiyonu için granül hücre boynuzları dentat gyrus (GrDG) katman kadar bölüm Bregma gözle görülür belirgin-3.00 mm.</li>
	<li>Toplamak bölümleri Hipokampal CA alt alanlar Bregma, koronal bölümlerde erimiş kadar-4.78 mm. Hippocampus kranyotomi ve yaralanma sitesi altında tam koleksiyonu bu ayrıntı sağlar. 
	Not: Bu Laboratuarı'ndan önceki yayınlarda gösterildiği şekilde en yaralı hücre aralığı içinde belli olacak ve gen veya mikroRNA ifade analizi için uygun.</li>
</ol> 2. İletişim kuralı boyama <ol><li>rahip için boyama, yıkama tüm dishware ve kimyasal duman kukuIeta RNase ortadan kaldırarak deterjan ile boyama alanında. Bu hazırlık açığının RNA bozulması nedeniyle kirlenme riski.</li>
	<li>Tüm boyama reaktifler ve nükleaz çözümlerinde ücretsiz su hazırlayın.</li>
	<li>Bir raf cryostat ve duman hood yerde saklanan slayt al. Slaytlar için 30 s. yer onları (nükleaz boş su ile hazırlanmış) çözümleri aşağıdaki gibi boyama içine ısıtmak izin: 1 dk, nükleaz ücretsiz için alkol % 75 su 1 dk, %1 Kresil mor 1 dk, nükleaz boş su 30 s, nükleaz boş su 30 s , % 95 alkol 30 s, %100 30 s, 3 dk Ksilen ve Ksilen 3 dakika süreyle alkol</li>
	<li>Raf duman başlıklı oda sıcaklığında en fazla 10 dakika kurumasını sağlar. Alternatif olarak, daha hızlı kurutma için raflar Rnase free vakum desiccator içine yerleştirin. Kurutulmuş sonra hemen LCM için devam.</li>
</ol> 3. Stereotaksik Atlas güdümlü lazer yakalama mikrodiseksiyon OKEK sistemi ile <ol><li>RNA analizi için herhangi bir LCM yordama başlamadan önce toplama alanı ve cihazın RNase ortadan kaldırarak deterjan ve % 100 ile çevresini aşağı silin alkol.</li>
	<li>Mikroskobunun temel açmadan önce birim oluşturma IR lazer üzerinde güç anahtarı çevirmek ve bilgisayar yazılımı--dan okul sırası başlamadan başlatmak sistem izin. 
	Not: Eğer bu sırada tamamlanmadı, belgili tanımlık bilgisayar yazılımı mikroskop tanımaz.</li>
	<li>Yazılım çizme ve onun başlatma adımları çalıştırmak sonra Ready &#34; mevcut sahne &#34; düğme içinde belgili tanımlık bilgisayar yazılımı &#34; kurulum paneli. &#34; modüler sahne nerede OKEK makro kapaklar ve slaytlar yüklenebilir ve Afganların pozisyona hareket edecek.</li>
	<li>Yer kalem membran slaytlar içine (en çok üç teker) sahipleri ile buzlu cam kenarına Droitisation karşı karşıya. 
	Not: sahibi yanlış yönde koymuş gerekir yazılım düzgün istenen IR veya UV kesim alanını tanımak mümkün olmayabilir.</li>
	<li>Tıklama &#34; Mem &#34; onay kutusu &#34; kap ve slayt alanını işleme &#34; ilgili slayt (örneğin, A, B veya C) yanında. Bu adım slayt bir membran cam slayt olup olmadığını gösterir. Sonra ilk yakalanması için istediğiniz slaytta'ı tıklatın.</li>
	<li>Doku konumu için döşenmiş bir resmi alıp kap yerleşimler, kullandığı yöndür kamera yapmak seçin &#34; görüntü &#34; araç çubuğu ve seçin &#34; edinme genel bakış. &#34; 
	Not: toplanmakta doku ile tanıdık bir kullanıcıysa, bu adımı konumlandırmak için el ile kaydırma topu kullanarak atlanabilir &#34; Bölge Merkezi &#34; koleksiyonu için.</li>
	<li>Alan Çinili görüntü (veya kiremitli görüntü olmadan göreli konumu) üzerine imleci getirin, sağ tıklatın ve seçin &#34; yer kap, Bölge Merkezi. &#34; yazılım otomatik olarak bir kap üzerinde Seçili pozisyon koyacağını.</li>
	<li>Bir yerde seçin. 
	Not: IR laser düzgün uyumlu ve sadece alanları nerede noktalar yazılım tarafından koyulur almak emin olmak için bu devam etmeden önce yer almalıdır.
	<ol>
		<li>Hiçbir doku mevcut nerede bir kap içinde alana taşıyın. Tıklatın &#34; ben &#34; içinde &#34; Microdissect Araçlar bölmesinde &#34; basıp &#34; kızılötesi bulun &#34; sekmesini. Bölmesinden bir IR testi nerede IR lazer ateş ediyor ve nokta boyutunu değerlendirmek için çekim yangın.</li>
		<li>İmleç, doğru tıkırtı IR ortasında nokta ve seçme &#34; yer alan IR Spot. &#34; 
		Not: Boyut ve IR ışın yoğunluğunu el ile değiştirerek değiştirilebilir &#34; güç, çapı veya süresi &#34; altında her nokta boyutu göstergesi veya değişken ölçek iletişim kutusunun altındaki hareket ettirerek. Birkaç test fotoğrafları uygun nokta boyutu sağlamak için ateş gerekir. IR lazer kap değişiklikleri veya slayt konumunu açık her zaman yeniden yer almalıdır.</li>
		<li>İçin UV kesme, UV lazer seçerek bulun &#34; UV bulun &#34; iletişim kutusunda sekmesini. 
		Not: çünkü UV lazer ve IR lazer büyük bir uyum içinde hareket, sürekli UV lazer konumu değişti her zaman yeniden bulmak için gerek yoktur.</li>
	</ol></li> <li>Seç &#34; serbest el çiziminin &#34; içinde seçenek &#34; Araçlar bölmesinde seçin &#34;. Bir dokunmatik ekran kalemi kullanarak, dokunmatik ekran ve stylus baş arasında temas kaybetmemek emin yaparken ilgi bölgesinin çevresini çizin. Başlangıcı ve endpoints birbirine bağlamak emin olun. 
	Not: IR noktalar otomatik olarak yazılım aracılığıyla belirtilen ama kullanıcı aşağı ek noktalar doku UV kesme gerçekleştirildikten sonra kap yapıştırılır sağlamak için koymak tercih edebilirsiniz.</li>
	<li>İçin FrA koleksiyonu, gerçekleştirmek ne zaman Bregma 5,16 mm M2 korteks görünür kadar kortikal doku brüt lazer yakalanması. 
	Not: FrA veya belirli hücre tipleri yalnızca belirli bölümlerine toplanır öyle ki bu ayrıntı tadil.</li>
	<li>İçin AcbC koleksiyon, bir alanını kapatmak aca bir mesafede lazer yakalama. 
	AcbC bir kabuk ve çekirdek farklı işlevleri yerine ve fizyolojik olarak benzersizdir. Böylece mümkün olduğunca yakın olarak beyin atlas izlemeniz önemlidir. Bu geçmiş bregma 0,84 mm, iki daha fazla toplamak için tavsiye edilir Milletlere de birbirleri ile yakından ilişkili olmak.</li>
	<li>Hp için koleksiyon, lazer yakalama CA 1 Bregma 3.00 mm başlayan ve tamamen kurulan GrDG morfolojik tanımlama için fiziksel bir dönüm noktası kullanarak 2 ve 3 Hipokampal alt alanlar. 
	Not: Bu çalışmanın amacı gereği,-4.78 mm, hangi görsel olarak noktası olarak demarcated zaman Hp alt dallar erimiş ve ventrally gelin Bregma toplamıyoruz. Bu alanda en yaralı olarak sinir hücreleri doğrudan yaralanma sitesi 6 altında keşfedilen seçildi.</li>
	<li>SCN koleksiyonu için görsel olarak och dorsal oturup sonra toplamak yoğun paketlenmiş çekirdeklerin tanımlar.</li>
	<li>(Yukarıda listelenen) bölgesi koleksiyonu sonra OKEK makro kapaklar için hareket &#34; QC pozisyon &#34; ve UV kesip doku görsel olarak sağlayarak tam doku uyumu membran için bağlı olduğu için denetleme. Hızlı bir şekilde yer kap ontoan 100 µL hücre lizis arabelleği içeren RNase free 0.5 mL ince duvarlı tepki tüp.</li>
	<li>Kısaca tam lizis sağlamak ve-80 ° C'de depolamak için girdap örnekleri Bu noktada, LCM durdu ve örnekleri depolanan aşağı akım genom analizi 6 için kullanana kadar.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gene+networks+to+brain+networks.">From gene networks to brain networks.</a> Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).</li><li>Mills, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+transcriptome+patterns+of+the+white+and+grey+matter+corroborate+structural+and+functional+heterogeneity+in+the+human+frontal+lobe.">Unique transcriptome patterns of the white and grey matter corroborate structural and functional heterogeneity in the human frontal lobe.</a> PLoS One. 8 (10), e78480 (2013).</li><li>Doppenberg, E. M., Choi, S. C., Bullock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+traumatic+brain+injury:+lessons+for+the+future.">Clinical trials in traumatic brain injury: lessons for the future.</a> J Neurosurg Anesthesiol. 16 (1), 87-94 (2004).</li><li>Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+and+analysis+of+amplified+antisense+RNA+from+distinct+cell+populations+of+the+young+and+aged+rat+brain:+effect+of+traumatic+brain+injury+on+hippocampal+gene+expression.">Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression.</a> Mol Brain Res. 122 (1), 47-61 (2004).</li><li>Bast, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+an+integrative+perspective+on+hippocampal+function:+from+the+rapid+encoding+of+experience+to+adaptive+behavior.">Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior.</a> Rev Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).</li><li>Rojo, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+stochastic+gene+expression+on+the+cell+survival+rheostat+after+traumatic+brain+injury.">Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury.</a> PLoS.One. 6 (8), e23111 (2011).</li><li>Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+correlates+of+age-specific+responses+to+traumatic+brain+injury+in+mice.">Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice.</a> Exp Gerontol. 41 (11), 1201-1205 (2006).</li><li>Shearer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+fluctuations+in+gene+expression+in+aging+hippocampal+neurons+could+be+exacerbated+by+traumatic+brain+injury.">Stochastic fluctuations in gene expression in aging hippocampal neurons could be exacerbated by traumatic brain injury.</a> Aging Clin.Exp.Res. 28 (2), 363-367 (2015).</li><li>Caeyenberghs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+structural+networks+and+executive+deficits+in+traumatic+brain+injury+patients.">Altered structural networks and executive deficits in traumatic brain injury patients.</a> Brain Struct.Funct. 219 (1), 193-209 (2014).</li><li>Bewernick, B. H., Kayser, S., Sturm, V., Schlaepfer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+nucleus+accumbens+deep+brain+stimulation+in+treatment-resistant+depression:+evidence+for+sustained+efficacy.">Long-term effects of nucleus accumbens deep brain stimulation in treatment-resistant depression: evidence for sustained efficacy.</a> Neuropsychopharmacology. 37 (9), 1975-1985 (2012).</li><li>Karatsoreos, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Circadian+Disruption+on+Mental+and+Physical+Health.">Effects of Circadian Disruption on Mental and Physical Health.</a> Curr.Neurol.Neurosci Rep. 12 (2), 218-225 (2012).</li><li>Drexel, M., Puhakka, N., Kirchmair, E., H&#246;rtnagl, H., Pitk&#228;nen, A., Sperk, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GABA+receptor+subunits+in+the+hippocampus+and+thalamus+after+experimental+traumatic+brain+injury.">Expression of GABA receptor subunits in the hippocampus and thalamus after experimental traumatic brain injury.</a> Neuropharmacology. 88, 122-133 (2015).</li><li>Huusko, N., Pitkanen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin+immunoreactivity+and+expression+of+GABAA+receptor+subunits+in+the+thalamus+after+experimental+TBI.">Parvalbumin immunoreactivity and expression of GABAA receptor subunits in the thalamus after experimental TBI.</a> Neuroscience. 267, 30-45 (2014).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The rat brain in stereotaxic coordinates. , (2013).</li><li>Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+enriched+populations+of+neurons+or+single+neurons+for+gene+expression+analysis+after+traumatic+brain+injury.">Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), 1-7 (2012).</li><li>Hellmich, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+analysis+reveals+common+pro-survival+mechanisms+of+metyrapone+and+carbenoxolone+after+traumatic+brain+injury.">Pathway analysis reveals common pro-survival mechanisms of metyrapone and carbenoxolone after traumatic brain injury.</a> PLoS.One. 8 (1), e53230 (2013).</li><li>Boone, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway-focused+PCR+array+profiling+of+enriched+populations+of+laser+capture+microdissected+hippocampal+cells+after+traumatic+brain+injury.">Pathway-focused PCR array profiling of enriched populations of laser capture microdissected hippocampal cells after traumatic brain injury.</a> PLoS.One. 10 (5), e0127287 (2015).</li><li>Boone, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+Brain+Injury-induced+Dysregulation+of+the+Circadian+Clock.">Traumatic Brain Injury-induced Dysregulation of the Circadian Clock.</a> PLoS.One. 7 (10), e46204 (2012).</li><li>Truettner, J. S., Motti, D., Dietrich, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+overexpression+increases+cortical+neuronal+vulnerability+to+injury.">MicroRNA overexpression increases cortical neuronal vulnerability to injury.</a> Brain Res. 1533, 122-130 (2013).</li><li>Hellmich, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+brain+injury+and+hemorrhagic+hypotension+suppress+neuroprotective+gene+expression+in+injured+hippocampal+neurons.">Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons.</a> Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).</li><li>Ginsberg, S. D., Alldred, M. J., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+levels+assessed+by+CA1+pyramidal+neuron+and+regional+hippocampal+dissections+in+Alzheimer's+disease.">Gene expression levels assessed by CA1 pyramidal neuron and regional hippocampal dissections in Alzheimer's disease.</a> Neurobiol.Dis. 45 (1), 99-107 (2012).</li><li>Elstner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+dopaminergic+neurons+in+Parkinson's+disease+and+aging+links+transcriptional+dysregulation+of+energy+metabolism+to+cell+death.">Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson's disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death.</a> Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+tissue+preparation+for+laser+capture+microdissection:+application+for+cell+type-specific+miRNA+expression+profiling+in+colorectal+tumors.">Improvement of tissue preparation for laser capture microdissection: application for cell type-specific miRNA expression profiling in colorectal tumors.</a> BMC.Genomics. 11, 163 (2010).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Memeli beyin moleküler çalışmalar için bir temel tekniği LCM haline gelmiştir. Bu makalede, IR ve UV kesme lazerler LCM sisteminde kullanarak herhangi bir memeli beyin bölgesinin genomik değişiklikleri yakalayabilir gösterilir. Bu bölgeler dahil olanlar Kresil mor veya Hematoksilen Eozin gibi geleneksel LCM uyumlu lekeleri ile tanımlanabilir. Sadece hücre örnekleri yeterli miktarda elde etmek için aynı zamanda RNA tüm tip-in aşağı akım için uygun bir kalite LCM örneklerinden izole etmek için lazer-yakalama işlemi ve yeteneği daha kalın 30 µm bölümlerinde kalem membran slaytlarda LCM gerçekleştirmek için hızını sağlar Genom analizi; Bu analizler microarrays16, PCR diziler17ve nicel gerçek zamanlı PCR18içerir.
Bizim veri LCM doku kullanmak çalışmaları için bir gerekçe sağlamak. Biz o miR-15b upregulated Hipokampus ve korteks (şekil 4) ama downregulated nucleus accumbens içinde ve fark Tby beyindeki etkileri anlayış biyolojik olarak uygun olmayabilir bulabilirsiniz. Bir önceki çalışma artar'nı kortikal nöronal yaralanma için olumsuz yanlısı hayatta kalma genler, Bcl-219gibi düzenleyen birkaç miRNAs overexpression sonucu önerdi. Hedef tarama analizi gösterir Bcl-2 de miR-15b tarafından düzenlenmiş; Böylece, mekanik bir açıklama neden bizim verileri göstermektedir beynin belirli bölgeler (yani, FCx) Tby için seçmeli olarak etkilenebilir. Çoğu genlerin birden çok miRNAs tarafından düzenlenir ve belirli hedef gen için herhangi bir miRNA değişiklikler birleştiriliyor zordur hatırlamak önemlidir. Ayrıca, bu verileri mikroRNA ve gen ifadesinde bazı değişiklikler bölgeye özgü beyin hasarı biyolojik kullanılabileceğini belirtmek. Nitekim, şu anda bu veri çalışmalarda kullanıyor nasıl yeni nöroprotektif uyuşturucu bileşikler antidepresan özellikleri ile differentially nöropsikiyatrik bozukluklar için bağlı beyin bölgeleri mikroRNA ve gen ifadesinde etkileyebilir. Bir çalışmamız slayt hazırlama işlemleri LCM için birden çok adımı sırasında RNA bütünlüğü tehlikeye haline kısıtlamasıdır. Bu iletişim kuralı RNA bozulması riskini azaltmak için gerekli adımları açıklar. İstatistik hesaplaması için kullanılan nispeten küçük örnek boyutu başka bir kısıtlamadır. Gelecekte örnek boyutunu artırma çalışmaları, gen ve miRNA ifade çeşitleri bireysel hayvanlar arasında etkilerini azaltmak gerekir.
LCM yararına insan hastalık ve hastalıklı dokuları20,21,22,23hayvan modelleri kullanarak translasyonel genomik çalışmalar gerçekleştirilmektedir. Belirli hücre popülasyonlarının yakalama yeteneği, farklı beyin bölgelerini transkripsiyon profilleri-cekti var olmak pek çok hücre tipleri bilinemez ve undecipherable bir karışımı. LCM yöntemlerle beyin yaralanması çalışmalarda şimdiki çabalar için beyin bölgesi belirli biyolojik betimlemek için ve nasıl onlar Tby biyolojik dolaşan ile ilişkilendirmek anlamaya neden olmuştur.

Son derece karmaşık ve farklı hücre türleri1binlerce yüzlerce ile memeli beynidir. Nitekim, insan çalışmaları frontal korteks gibi bölgelerde yapısal göstermiştir ve işlevsel farklılıklar beyaz ve gri konuda ayrı ve farklı transkripsiyon profilleri2' de yansıtılır. Beyin heterojenite gen ifadesi verileri yorumlamak için büyük bir engel oldu ve beyin hasarı alanında. Bu belirsizlik içinde preklinik çalışmalar daha sonra başarısız olan klinik tedaviler beyin yaralanması3için yüzlerce neden olmuştur.
Travmatik beyin hasarı (TBY) incelemek için lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) yöntemleri kullanın-gen bozukluk sıçan beyin4hipokampüs, öğrenme ve hafıza5için esastır bir beyin bölgesi odaklanan, indüklenen. Yakalama lazer ve hem ölüyor ve nöronlar hayatta gen ekspresyonu analiz yeteneği bize Tby6' dan sonra stochasticity (nöronal hayatta kalma) sonucu belirlemede gen ifadesinde rolünün daha büyük bir anlayış verir. LCM teknikleri de genç ve atma fareler7'yi veya fareler8karşılaştırırken Hipokampal nöronlar Tby etkilerini keşfetmek için yararlı kanıtlanmış.
Son çalışmalarda, sıçan beyin olumsuz fareler ve yönetim işlevi (Yani frontal korteks9) ve Tby comorbidities ile ilişkili olan insan Tby hastalarda odaklanarak Tby tarafından etkilenen diğer bölgelerinde incelendiğinde; Bu comorbidities depresyon (nucleus accumbens10)numaralar›n› ve sirkadiyen ritim bozuklukları (suprachiasmatic çekirdeği11) içerir. Önceki çalışmalar, Huusko ve Pitkanen12 ve Drexel vd. 13 LCM gen ekspresyonu talamus ve hipotalamus incelemek için kullanılan. Bizim çalışma önceden bu gözlemler oluşturur ve dört diğer beyin bölgeleri içerir. Tby sonra indüklenen bölgeye özgü moleküler değişiklikler çalışmaya, belirlenmesi ve hücre tipleri bir LCM sistemini kullanarak bu bölgelerde elde uzmanlık kazanmak için gerekli. UV-kesme ve kızılötesi (IR) lazerler istenen beyin bölgeleri kesin mikrodiseksiyon için izin. Burada, biz nasıl sıçan beyin atlas14, stereotaksik koordinatları belirlemek ve differentially deneysel sıvı-perküsyon beyin yaralanması yöntemi tarafından etkilenen yakalama dört sıçan beyin bölgeleri lazer rehberliğinde bu LCM sistem kullanım tarif 4.

<table><tbody><tr><td>Arcturus Laser Capture Microdissection System</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus PEN Membrane Glass Slides&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>LCM0522</td><td></td></tr><tr><td>Capsure LCM caps</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>LCM0211/LCM0214</td><td></td></tr><tr><td>Cresyl Violet Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>Xylene (Histological grade)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof (Histological grade)</td><td>UTMB Pharmacy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous Micro- Kit</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Gene Expression Primer/Probes</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>Taqman microRNA Expression Primer/Probes</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>A25576</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 96 System</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

stereotactic atlas-guided laser capture microdissection of brain regions affected by traumatic injury

Yeteneğini belirli beyin bölgeleri ilgi izole etmek mekansal dağılımı korumaz doku ayırma teknikleri içinde engellemiştir. Sürecin kendisi ifade desenleri tek tek hücreleri içinde değiştirebilirsiniz çünkü bu tür teknikler da potansiyel gen ifade analizi eğ. Burada seçerek travmatik beyin hasarı (TBY) tarafından değiştirilmiş bir Nisl Protokolü ve sıçan beyin atlas rehberliğinde boyama (Kresil mor) kullanarak etkilenen belirli beyin bölgeleri toplamak için lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) yöntemi açıklanmaktadır. LCM beyin bölgelerinde yerel konumlarını ve anatomik yerler belirli her bölgenin kimliği için kullanma yeteneği erişim sağlar. Bu amaçla, LCM daha önce beyin bölgesi belirli bir gen ifadesinde Tby incelemek için kullanılmıştır. Bu iletişim kuralı Tby kaynaklı değişikliklere incelenmesi farklı beyin bölgeleri içinde aynı hayvan gen ve mikroRNA ifadede izin verir. Bu iletişim kuralı prensipleri tadil ve genomik ifade diğer hastalık ve/veya hayvan modelleri inceleyerek çalışmalar geniş bir uygulanır.

Şekil 1 ' de sunulan şematik destekli atlas LCM belirli beyin bölgeleri ve potansiyel aşağı akım çözümleme uygulamaları genel iş akışı gösterilmektedir. Bu çalışma odaklı dört beyin bölgelerinde ilgili Tby patofizyolojisi ve comorbidities gelişimi: FrA, AcbC, SCN (sahne) ve Hp. Bir LCM içinde mevcut belirli beyin bölgeleri anatomik Mekanlar kez tanımlanmış sınırları eksikliği tarafından Şekil 2 (A, D, G, J)görüldüğü gibi gizlenmiş olduğunu kısıtlamasıdır. Bir beyin atlas kesit rehberlik ve yakalama, özel bölgelerin lazer kullanımı beyin bölgeleri dışında hedef ile örnek bulaşma olasılığını azaltır. Bakım kesit sırasında ve sonrasında Nisl boyama doku işaretlerini, izlemeye alınır, LCM teknoloji hücre, hücre çekirdeği veya bölgeleri15ayrı nüfus edinme için son derece tutarlı bir yol sağlar. Genler ve vekil olarak hizmet verebilir mikroRNA'lar beyin bölgesi belirli yaralanma non-invaziv biyolojik tanımlamak için bu çalışmaların uzun vadeli hedefleri vardır. Bu biyomarker geliştirme boru hattı ilk adımda deneysel Tby sonra doku özgü transkripsiyon değişikliklerin karakterizasyonudur. Bu veriler daha sonra biofluids dolaşan yaralanma kaynaklı değişiklikler ile ilişkili olabilir.
Sunulan yordamları RNA analizi nicel gerçek zamanlı PCR (RT-qPCR) önce toplam OKEK RNA'ın ters transkripsiyon yoluyla izin vermek için RNA bozulması riskini azaltmak için optimize. Toplam RNA (küçük ve büyük RNA türler de dahil olmak üzere) bireysel beyin bölgelerden lazer yakalanan doku üzerinde bir sütun tabanlı yalıtım yöntemiyle izole edildi. RNA bütünlüğü, kalite ve miktar yalıtım yordamlar sonra değerlendirmek için RNA örnekleri kısa bir süre 70 ° C'de denatüre ve üzerinde bir RNA Çözümleyicisi'ni çalıştırma. Nitel ölçümleri en yüksek genlikleri 18s ve 28s rRNA gruplarından () genel yıkımı temsilcisi olabilir, hangişekil 3), analiz ve "RNA bütünlük numarasını" (RIN) kullanarak dahil. Eğer dikkatli RNase free teknikleri kullanarak, RNA LCM örnekleri 6-8 arasında RINs sonuçlarında genellikle izole. Daha düşük bir RIN RNA kalitesiz ima ve potansiyel olarak mikroRNA ve gen ifade analizi doğruluğunu azaltabilir. Buna karşılık, daha yüksek bir RIN RNA çözümleme oluşturulan sonuçlar geçerliliğini güven geliştirin olabilir.
RT-qPCR astar/sonda kümeleri kullanarak bireysel genler ve mikroRNA (şekil 4) için gerçekleştirildi. Yaklaşık 1 Toplam RNA'ın ng cDNA ters transkripsiyonu ve qPCR üretici protokole göre gerçekleştirilmesi için önce önceden güçlendirilmiş. Bu çalışmada değerlendirildi yaralanma ile ilgili genler dahil BCL2 ilişkili X, Apoptozis regülatörü (Bax), B-hücre CLL/Lenfoma 2 (Bcl-2), Caspase 3, Apoptosis-Related sistein peptidaz (Casp3) , (Bdnf) Nörotrofik faktör beyin türetilen ve Protein 1 bağlayan kamp duyarlı öğe (Creb). Çünkü bireysel ölen nöronlar içinde deneysel Tby sonra değiştirilecek gösterilmiştir miR-15b seçildi. Ayrıca deneysel olarak geçerliliği ve bioinformatically gen hedefleri yanlısı yaşam fonksiyonları (yayınlanmamış veri) ile tahmin. Normalleştirilmiş kat-değişim oranları sırasıyla Tby hayvanlar ve saf denetimleriyle normalleştirme endojen gen (Gapdh) veya küçük RNA (U6), gen ve mikroRNA ifade düzeylerinin karşılaştırılması ΔΔCt yöntemi ile hesaplanmıştır. Bu gen veya mikroRNA genel bir upregulation 1 yukarıda bir kat değişiklik gösterir ve bunun tersi olarak, bir kat değiştirmek 1 bir downregülasyon gösterir daha düşük. İstatistiksel analiz önemli değişiklikler Tby ve saf kontrolü (p ≤ 0,05) arasında gen ifadesinde bu beyin bölgesi bağımlı olduğunu gösterdi. Herhangi bir önemli değişiklik miR-15b ifade Tby ve saf denetimleri arasında algılandı, ancak eğilimleri doğru bir beyin bölgesi bağımlı moda yüksek ve düşük ifade edildi. Bu veriler o daha fazla en iyi duruma getirme değişiklikleri mikroRNA ifadesinde değerlendirmek için gerekli olduğunu gösteriyor. Örnek boyutu ifade doğal değişkenlik nedeniyle kısmen istatistiksel anlamlılık kazanmak için çok küçük mümkündür. MikroRNA ifade değişiklikleri Tby ve cerrahi hazırlık nedeniyle değil atfedilen ve gelecekteki çalışmalar o gen emin olmak için sahte ile çalışan hayvanlar yer alacak.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig1.jpg"> 
Şekil 1. İş akışını, Atlas güdümlü OKEK aşağı akım genom analizi için. (A-F) Hayvan hazırlık yordamlardan aşağı akım qPCR analiz için: (A) yetişkin, erkek Sprague Dawley Rat (~ 6 hafta-in yaş ve 300 gr ağırlığında) anestezi, sıvı perküsyon Tby tabi ve insanca euthanized 24 saat sonra yaralanma. (B) seri bölümlerini (30 µm) taze donmuş beyin Paxinos ve Watson'ın sıçan beyin Atlas belirli beyin bölgeleri (FrA, AcbC, Hp, SCN (sahne)) koordinatlarını temel alır. (C) bölümler sabit, Nisl lekeli (%1 Kresil Menekşe), susuz ve kuru hava. (D). LCM üzerinde gerçekleştirilen bir OKEK sistemiyle beyin bölgeleri tespit. (E) OKEK makro kapaklar RNase free 0.5 mL tüp 100 μL hücre lizis arabelleği ile üzerine transfer ve aşağı akım genomik analiz için RNA izolasyonu kadar-80 ºC depolanır. RNA moleküler hedef Tby sonra ve/veya faiz (F)beyin bölgeleri arasında fark ifade incelemek için gen veya mikroRNA RT-qPCR analizi için ters transkripsiyonu olabilir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig2.jpg"> 
Şekil 2. Tby OKEK etkilenen beyin bölgeleri. Doku toplanan Ipsilateral taraftan yaralanma sitesi bölümlerini IR ve UV ile temsilcisi görüntüleri lazer LCM sistem işlevleri (A-Ben). Doku bir cryostat (30 µm) kesitli ve kalem membran slaytlar üzerinde toplanır. Bölümler vardı sonra sabit, Nisl Kresil ile Menekşe (% 1) lekeli ve anatomik yerler Paxinos ve Watson'ın sıçan beyin Atlas içinde başvurulan temel alan belirli beyin bölgeleri tanımlamak için susuz. (A-C) Frontal Birliği korteks (FrA) (D-F) bileşenleri dentat gyrus (GrDG) granül tabakası tam biçimli boynuzları yanında bulunan hippocampus (Hp) CA1, CA3 ve CA2 piramit kat alanı. (G-ı) Nucleus accumbens co yüzölçümü(AcbC) yeniden proksimal ve rostral anterior komissür (aca) için. (J-K) Suprachiasmatic çekirdeği (SCN) supraoptic hemisferlerine (och) rostral. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig3.jpg"> 
Şekil 3. RNA kalite temsilcisi taranmasını. Temsilcisi electropherograms ve LCM türetilmiş RNA görüntülerini ilişkili jel doku (A-D)toplanan. Electropherograms ve ilişkili jel görüntüleri 18s ve 28s rRNA tepeler ve jel Grup temel sağlam RNA göster. Bu RNA tüm genomik dahil olmak üzere aşağı akım uygulamaları ve proteomik analizleri için uygundur. (A) ön Birliği korteks (FrA) RNA. RIN 6.1. (B) Hippocampus (Hp) RNA. RIN 4.4. (C) , (AcbC) RNA Nucleus accumbens çekirdek. RIN 7.3. (D) Suprachiasmatic çekirdeği (SCN) RNA. RIN 7.6. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig4.jpg"> 
Şekil 4. Aşağı akım analizi beyin bölge-özgül gen ve mikroRNA ifade üzerinden RT-qPCR. Bireysel RT-qPCR genler (Bax, Bcl-2, Bdnf, Casp3, Creb) ilgi ve mikroRNA (miR-15b) ilgi için Tby sonra yakalanan lazer beyin bölgeleri üzerinde gerçekleştirilen (Hp ve AcbC n = 5, FrA n = 4) ve zarar görmemiş naif hayvanlar için karşılaştırıldığında (n = 4). Tby patogenezi ile ilgili genlerin analizi gerçekleştirilen saf kontrol beyin bölgelerine göre normalleştirilmiş kat değişim oranları olarak sunulan Hp, AcbC, FCx. verilerin için (Unpaired t test Welch düzeltme ± SEM; * p ≤ 0,05) (A). MiR-15b farklı beyin bölgelerindeki farklı ifade (± SEM) saf denetimine göre normalleştirilmiş kat değişiklikler olarak sunulmaktadır (B). SCN verilerden (n = 2) dahil değildir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury at JoVE.com

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Lazer yakalama mikrodiseksiyon farklı beyin bölgelerini mikroRNA ve gen analizi için farklı hücre popülasyonlarının örnekleri almak için nasıl kullanılacağını açıklar. Bu teknik travmatik beyin hasarı sıçan beyin belirli bölgelerinde farklı etkileri bir çalışma sağlar.

Stereotaksik Atlas güdümlü lazer yakalama mikrodiseksiyon travma yaralanma tarafından etkilenen beyin bölgeleri

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

stereotactic-atlas-guided-laser-capture-microdissection-brain-regions

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.1K Görüntüleme.  University of Texas Medical Branch. Lazer yakalama mikrodiseksiyon farklı beyin bölgelerini mikroRNA ve gen analizi için farklı hücre popülasyonlarının örnekleri almak için nasıl kullanılacağını açıklar. Bu teknik travmatik beyin hasarı sıçan beyin belirli bölgelerinde farklı etkileri bir çalışma sağlar.

Video: Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Travmatik Beyin Hasarı Sonrası Nöronlar veya gen ekspresyon analizi için Tek Nöron zenginleştirilmiştir Populasyonlarının Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Nörobilim

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell populations. To characterize proteome-level variation and tumor heterogeneity at scale, high-throughput methods are needed to selectively isolate discrete cellular populations in solid tumor malignancies. This protocol describes a high-throughput workflow, enabled by artificial intelligence (AI), that segments images of hematoxylin and eosin (H&#38;E)-stained, thin tissue sections into pathology-confirmed regions of interest for selective harvest of histology-resolved cell populations using laser microdissection (LMD). This strategy includes a novel algorithm enabling the transfer of regions denoting cell populations of interest, annotated using digital image software, directly to laser microscopes, thus enabling more facile collections. Successful implementation of this workflow was performed, demonstrating the utility of this harmonized method to selectively harvest tumor cell populations from the TME for quantitative, multiplexed proteomic analysis by high-resolution mass spectrometry. This strategy fully integrates with routine histopathology review, leveraging digital image analysis to support enrichment of cellular populations of interest and is fully generalizable, enabling harmonized harvests of cell populations from the TME for multiomic analyses.

This protocol describes a high-throughput workflow for artificial intelligence-driven segmentation of pathology-confirmed regions of interest from stained, thin tissue section images for enrichment of histology-resolved cell populations using laser microdissection. This strategy includes a novel algorithm enabling the transfer of demarcations denoting cell populations of interest directly to laser microscopes.

Tümör Mikroçevresinin Mikro Ölçekli Proteomik Analizi için Endüstriyelleşmiş, Yapay Zeka Rehberliğinde Lazer Mikrodiseksiyonu

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...

Kanser Araştırmaları

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no effective treatment for it yet. Limitations of currently used animal models impede understanding of the pathology mechanism. Multiphoton microscopy allows studying cells and tissues within intact animal brains longitudinally under physiological and pathological conditions. Here, we describe two models of acute brain injury studied by means of two-photon imaging of brain cell behavior under posttraumatic conditions. A selected brain region is injured with a sharp needle to produce a trauma of a controlled width and depth in the brain parenchyma. Our method uses stereotaxic prick with a syringe needle, which can be combined with simultaneous drug application. We propose that this method can be used as an advanced tool to study cellular mechanisms of pathophysiological consequences of acute trauma in mammalian brain in vivo. In this video, we combine acute brain injury with two preparations: cranial window and skull thinning. We also discuss advantages and limitations of both preparations for multisession imaging of brain regeneration after trauma.

Acute brain trauma is a severe injury that has no adequate treatment to date. Multiphoton microscopy allows studying longitudinally the process of acute brain trauma development and probing therapeutical strategies in rodents. Two models of acute brain trauma studied with in vivo two-photon imaging of brain are demonstrated in this protocol.

Boyuna İki foton görüntüleme ile takip Farelerde Akut Beyin Travma

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Tıp

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI). Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, social, and economical effects are staggering. Therefore, further research into the effects of TBI and effective treatments is necessary. The controlled cortical impact (CCI) model induces traumatic brain injuries ranging from mild to severe. This method uses a rigid impactor to deliver mechanical energy to an intact dura exposed following a craniectomy. Impact is made under precise parameters at a set velocity to achieve a pre-determined deformation depth. Although other TBI models, such as weight drop and fluid percussion, exist, CCI is more accurate, easier to control, and most importantly, produces traumatic brain injuries similar to those seen in humans. However, no TBI model is currently able to reproduce pathological changes identical to those seen in human patients. The CCI model allows investigation into the short-term and long-term effects of TBI, such as neuronal death, memory deficits, and cerebral edema, as well as potential therapeutic treatments for TBI.

Traumatic brain injuries (TBIs) remain a serious health problem. Using the controlled cortical impact surgery model, research on the effects of TBI and possible treatment methods may be performed.

Travmatik Beyin Hasarı için Kontrollü Kortikal Etki Modeli

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Serebellar Aksonlar Lazer Nanosurgery<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

A Micro-CT-based Method for Characterizing Lesions and Locating Electrodes in Small Animal Brains

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that requires manual estimation. Here, we describe a simple, straightforward method for quantifying lesions and locating electrodes in the brain that is less laborious and yields more detailed results. Whole brains are stained with osmium tetroxide, embedded in resin, and imaged with a micro-CT scanner. The scans result in 3D digital volumes of the brains with resolutions and virtual section thicknesses dependent on the sample size (12&#8211;15 and 5&#8211;6 &#181;m&#160;per voxel for rat and zebra finch brains, respectively). Surface and deep lesions can be characterized, and single tetrodes, tetrode arrays, electrolytic lesions, and silicon probes can also be localized. Free and proprietary software allows experimenters to examine the sample volume from any plane and segment the volume manually or automatically. Because this method generates whole brain volume, lesions and electrodes can be quantified to a much higher degree than in current methods, which will help standardize comparisons within and across studies.

This article describes a straightforward method to prepare small animal brains for micro-CT imaging, in which lesions can be quantified and electrodes located with high precision in the context of the whole brain.

Lezyonlar karakterize ve küçük hayvan beyinlerinde elektrot bulmak için bir mikro-CT-esaslı Yöntem

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that ...

Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats

A common technique for inducing stroke in experimental rodent models involves the transient (often denoted as MCAO-t) or permanent (designated as MCAO-p) occlusion of the middle cerebral artery (MCA) using a catheter. This generally accepted technique, however, has some limitations, thereby limiting its extensive use. Stroke induction by this method is often characterized by high variability in the localization and size of the ischemic area, periodical occurrences of hemorrhage, and high death rates. Also, the successful completion of any of the transient or permanent procedures requires expertise and often lasts for about 30 minutes. In this protocol, a laser irradiation technique is presented that can serve as an alternative method for inducing and studying brain injury in rodent models.
When compared to rats in the control and MCAO groups, the brain injury by laser induction showed reduced variability in body temperature, infarct volume, brain edema, intracranial hemorrhage, and mortality. Furthermore, the use of a laser-induced injury caused damage to the brain tissues only in the motor cortex unlike in the MCAO experiments where destruction of both the motor cortex and striatal tissues is observed.
Findings from this investigation suggest that laser irradiation could serve as an alternative and effective technique for inducing brain injury in the motor cortex. The method also shortens the time for completing the procedure and does not require expert handlers.

The protocol presented here shows a technique to create a rodent model of brain injury. The method described here uses laser irradiation and targets motor cortex.

Farelerin Motor Korteksinde LazerE Bağlı Beyin Hasarı

A common technique for inducing stroke in experimental rodent models involves the transient (often denoted as MCAO-t) or permanent (designated as MCAO-p) ...

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, microvascular proliferation, mesenchymal transformation and necrosis characterize the histological heterogeneity of high-grade gliomas. Our laboratory has demonstrated that the presence of high densities of mesenchymal cells, named oncostreams, correlate with tumor malignancy. We have developed a unique approach to understand the mechanisms that underlie glioma&#39;s growth and invasion. Here, we describe a comprehensive protocol that utilizes laser capture microdissection (LMD) and RNA sequencing to analyze differential mRNA expression of intra-tumoral heterogeneous multicellular structures (i.e., mesenchymal areas or areas of tumor invasion). This method maintains good tissue histology and RNA integrity. Perfusion, freezing, embedding, sectioning, and staining were optimized to preserve morphology and obtain high-quality laser microdissection samples. The results indicate that perfusion of glioma bearing mice using 30% sucrose provides good morphology and RNA quality. In addition, staining tumor sections with 4% Cresyl violet and 0.5% eosin results in good nuclear and cellular staining, while preserving RNA integrity. The method described is sensitive and highly reproducible and it can be utilized to study tumor morphology in various tumor models. In summary, we describe a complete method to perform LMD that preserves morphology and RNA quality for sequencing to study the molecular features of heterogeneous multicellular structures within solid tumors.

Laser microdissection (LMD) is a sensitive and highly reproducible technique that can be used to uncover pathways that mediate glioma heterogeneity and invasion. Here, we describe an optimized protocol to isolate discrete areas from glioma tissue using laser LMD followed by transcriptomic analysis.

İntratümöral Heterojenite, Oncostreams ve Invasion'ın Mekansal ve Moleküler Karakterizasyonu için Glioma Alt Bölgelerinin Lazer Yakalama Mikrodizması

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, ...

Injection of Hydrogel Biomaterial Scaffolds to The Brain After Stroke

Stroke is the leading cause of disability and the fifth-leading cause of death in the United States. Approximately 87% of all strokes are ischemic strokes and are defined as the sudden blockage of a vessel supplying blood to the brain. Within minutes of the blockage, cells begin to die and result in irreparable tissue damage. Current therapeutic treatments focus on clot removal or lysis to allow for the reperfusion and prevent more severe brain damage. Although transient brain plasticity may salvage some of the damaged tissue over time, significant fractions of patients are left with neurological deficits that will never resolve. There is a lack of therapeutic options to treat neurological deficits caused by stroke, emphasizing the need to develop new strategies to treat this growing patient population. Injectable biomaterials are currently being designed to enhance brain plasticity and improve endogenous repair through the delivery of active agents or stem cells. One method to test these approaches is to utilize a rodent stroke model, inject the biomaterial into the stroke core, and assess repair. Knowing the precise location of the stroke core is imperative for the accurate treatment after stroke, therefore, a stroke model that results in a predictable stroke location is preferable to avoid the need for imaging prior to injection. The following protocol will cover how to induce a photothrombotic stroke, how to inject a hydrogel in a controlled and precise manner, and how to extract and cryosection the brain while keeping the biomaterial intact. In addition, we will highlight how these same hydrogel materials can be used for the co-delivery of stem cells. This protocol can be generalized to the use of other injectable biomaterials into the stroke core.

Stroke is a global issue with minimal treatment options and no current clinical therapy for regenerating the lost brain tissue. Here we describe methods for creating precise photothrombotic stroke in the motor cortex of rodents and subsequent injection of hydrogel biomaterials to study their effects on tissue regeneration after stroke.

İnme Sonrası Beyne Hidrojel Biyomalzeme İskelelerinin Enjeksiyonu

Stroke is the leading cause of disability and the fifth-leading cause of death in the United States. Approximately 87% of all strokes are ischemic strokes ...

Biyoloji

Cryopreserved Tissue Section Fixation and Staining: A Procedure to Process Frozen Brain Tissue Sections for Laser Microdissection

Source: Comba, A. et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/60939/laser-capture-microdissection-glioma-subregions-for-spatial-molecular">Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2020)
This video presents the fixation and staining method to process frozen mouse brain tumor tissue. The processed tissue helps differentiate and obtain a specific population of cells during subsequent laser capture microdissection.

Dondurularak Saklanmış Doku Kesiti Fiksasyonu ve Boyama: Lazer Mikrodiseksiyon için Donmuş Beyin Dokusu Kesitlerini İşleme Prosedürü

Source: Comba, A. et al. Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, ...