Bu yöntemle tek bir hematopoetik kök hücredeki mutasyon sayısını doğru bir şekilde belirleyebiliriz. Bu mutasyonlar mutasyon süreçlerini çözmek ve hematopoetik soyları incelemek için kullanılabilir. Yöntemimiz, hematopoetik kök hücreleri in vitro klonlayarak tüm genom amplifikasyon tekniklerinin kullanılmasını önler ve bu da daha düşük hata oranları ve downstream analizinin yararları ile sonuçlanır.
Hematopoetik kök hücrelerin genomlarında bulunan mutasyonel desenler, maruz kaldıklarını gösteren mutajenik ve DNA onarım süreçlerini ortaya çıkarabilir. Metin protokolünde açıklandığı gibi örnek malzeme ve boyama hazırlanması ile bu prosedüre başlayın, sonra hematopoetik kök ve ata hücresi veya HSPC kültür ortamı 25 mililitre hazırlamak. Her kuyuda 75 mikrolitre HSPC kültür ortamı ile bir hücre kültürü 384 iyi plaka doldurun.
Dış kuyularda ortamın buharlaşmasını önlemek için, dış kuyuları 75 mikrolitre steril su veya PBS ile doldurun ve bu kuyuları hücre sıralamaiçin kullanmayın. Uygun sinyal HSPC'lerinin doğru sıralanması bu protokoldeki en kritik adımdır. HSPC sıralama için kapıları, lekeli örnekten 10.000 hücredeki lekesiz bir kontrole göre ayarlayın.
Doğrusal ileri dağılım yüksekliği ve ileri dağılım alanı fraksiyonu etrafında bir geçit çizerek tek hücreleri geçit. Soy fraksiyonu için bir geçit çizmek için lekesiz kontrol fraksiyonu kullanın. CD34 pozitif hücreler için geçitler çizin ve CD38 negatif, CD45RA negatif hücreler için belirli bir kapı ayarlayarak bu alt kümeyi daha da karakterize edin.
384 kuyulu plakayı faks makinesine yükleyin ve tek hücreleri sıralayın. Faks makinesine uygulanabilirse, sıralanmış hücrelerin izlenmesini etkinleştirmek için dizin sıralama verilerini tutma seçeneğini belirleyin. Kültür tek tek sıralanmış HSC'ler için, şeffaf polietilen sargı kapağı ile 384-iyi kültür plakası sarın.
384 kuyulu plakayı %5 karbondioksitiçeren nemlendirilmiş 37 derecelik bir kuvöze aktarın ve görünür klonlar ortaya çıkana kadar üç ila dört hafta kuvözde tutun. Dört haftalık kültürden sonra, hangi kuyuların %30 veya daha yüksek bir kesişme alanı olduğunu belirleyin. Her koni için, 1,5 mililitrelik mikrotüpleri %1'lik Bir mililitre BSA ve PBS ile doldurun ve tüpü ilgili kuyuya göre etiketlayın.
Pipet ucuna yapışan hücre sayısını en aza indirmek için %1 BSA ve PBS içeren bir pipet ucunu önceden ısla. 75 mikrolitre olarak belirlenen 200 mikrolitrelik pipet ile kuyunun dibini kazırken orta yı en az beş kez yukarı ve aşağı şiddetle pipetler. Hücre süspansiyonu, kuyuya karşılık gelen etiketli mikrotüpte toplayın.
Maksimum hücre alımını sağlamak için 75 mikrolitreye kadar taze %1 BSA ve PBS ile kuyuda pipetingi tekrarlayın. Klonsal olarak kültürlü hücreler kuyunun dibine yapışabilir. Tüm hücrelerin toplanıp toplanmadığından emin olmak için standart, ters ışık mikroskobu kullanarak kuyuları inceleyin.
%30'dan fazla biraraya gelen tüm kuyular hasat edilmişse, 384 kuyuluk plakayı kuvöze geri yerleştirin. Klonal kültürler beş haftaya kadar çoğalabilir. Hücre süspansiyonundan 5 dakika 350 kez aşağı doğru çevirin.
Küçük bir pelet görünür olmalıdır. Dikkatle supernatant yaklaşık beş mikrolitre hariç tüm kaldırın. Hücre peletleri eksi 20 derecede dondurulabilir ve DNA izolasyonundan önce birkaç ay saklanabilir.
Siyonun ilk dallarında bulunan mutasyonlar da toplu örneklemde alt klonal olarak bulunacaktır. Daha sonraki dallanma soyu sadece HSPC'ler arasında paylaşılan mutasyonlarla tanımlanır. Klonların bir alt kümesinde bulunan ve toplu olarak subklonaly mevcut mutasyonları tanımlamak için, klonlar arasında paylaşılan somatik mutasyonlar için ilk filtre.
Unix tabanlı bir terminalde filtersomatic'i edin. ne dosya pats ayarlamak ve diğer parametreleri ayarlamak. Filtresomatik çalıştırın.
pi komut dosyası. LowVAF topluyu kullanarak subkonnaly olarak bulunan mutasyonlar için filtre uygulayın. bir Unix tabanlı terminalde r komut dosyası.
Bu paylaşılan ve benzersiz tek nükleotit türevleri için ayrı vcf dosyaları oluşturacaktır. Toplu örneklemde bulunmayan klonlar arasında paylaşılan tüm mutasyonları, tüm mutasyon konumlarını örtüşerek belirleyin. IgV kısaltılmış Integrative Genomic Viewer kullanarak manuel inceleme ile yanlış pozitif hariç.
Mutasyon tüm klonlarda germline mevcut olduğunda veya kötü eşlenen bölgelerde mevcut olduğunda mutasyonlar yanlış olarak kabul edilir. Gerçek mutasyonlar iki klon arasında paylaşılabilir veya subclonaly toplu olarak mevcut olabilir. Tüm paylaşılan loci'yi hedefli veya sanger sıralamasını kullanarak bağımsız olarak yeniden sırala.
Paylaşılan mutasyonları kullanarak, mutasyonun mevcut olmadığını ve mutasyonun varlığını gösteren bir mutasyona karşı ikili bir mutasyon tablosu oluşturun. Mutasyon ikili tablosunu, R tabanlı işlevleri kullanan hücreler arasındaki soy ilişkilerini gösteren bir dendrogramla birlikte ısı haritası olarak çıktı. Isı haritası her hücre için mutasyon durumunu gösteriyor.
Kopya numarası değişikliklerini denetlemek için kontrol üç c tarafından oluşturulan kopya numarası analizinin örnek çıktısı olarak gösterilir. Tek nükleotit varyant filtreleme tarafından oluşturulan varyant alel fraksiyonu çizimi, örnekteki varyant alel frekanslarının histogramıdır. Yoğunluk çizimindeki 0,5'lik bir tepe, örneğin klonal olduğunu gösterir.
Burada 96 trinükleotit çizimi üreten tipik bir mutasyonal desen analizi gösterilmiştir. Farklı mutasyon türlerinin sayısallaştırılmasına ek olarak bu araçla imza çıkarma da yapılabilir. Klonlar arasında paylaşılan veya germline kontrolünde ki bir klonda bulunan mutasyonlar IGV kullanılarak doğrulanır.
Mutasyonlar, örnekte mevcut olduğunda doğru olarak kabul edilir ve germline yüksek varyant alel frekans düzeylerinde değildir. Mutasyonlar IGV mevcut değil, hangi kötü eşlenen bölgelerde olabilir yanlış olarak kabul edilir. Diğer durumlarda, tek nükleotit varyant filtreleme ile tespit edilen olaylar germline varyantları cevapsız.
Seçilen klonlarda bu mutasyonlar için mutasyonların hedeflenen sıralama ile bağımsız olarak sıralanması şiddetle tavsiye edilir. Klonlar arasında paylaşılan somatik mutasyonların tespitinden sonra, ikili bir matris oluşturulur, a ile m.the gelişimsel soy ağacı gösterilir paylaşılan mutasyonlar ile ve olmadan hücreleri içeren bir ısı haritası oluşturulur. Burada sunulan meta için bir sonraki adım olarak, hemopoetik kök hücrelerde aktif olan mutasyonel süreçler mutasyonel imza analizi kullanılarak belirlenebilir.
