Com este método, podemos determinar com precisão o número de mutações em uma única célula-tronco hematopoiética. Essas mutações podem ser usadas para decifrar processos mutacionais e dissecar linhagens hematopoiéticas. Nosso método evita o uso de técnicas de amplificação do genoma inteiro clonando as células-tronco hematopoiéticas in vitro, o que resulta em menores taxas de erro e benefícios à análise a jusante.
Os padrões mutacionais presentes nos genomas das células-tronco hematopoiéticas podem revelar os processos de reparação mutagênico e o DNA aos quais foram expostos. Inicie este procedimento com a preparação de material amostral e coloração conforme descrito no protocolo de texto, em seguida, prepare 25 mililitros de haste hematopoiética e célula progenitora, ou meio de cultura HSPC. Encha uma cultura celular 384 bem-placa com 75 microliters de meio de cultura HSPC em cada poço.
Para evitar a evaporação do meio nos poços externos, encha os poços externos com 75 microliters de água estéril ou PBS, e não use esses poços para triagem celular. A classificação correta dos HSPCs de sinal viável é o passo mais crítico neste protocolo. Definir portões para a classificação HSPC com base em um controle não manchado em 10.000 células da amostra manchada.
Gate únicas células desenhando um portão em torno da altura de dispersão linear para a frente versus fração da área de dispersão para a frente. Use a fração de controle não manchada para desenhar um portão para a fração de linhagem. Desenhe portões para células positivas CD34 e caracterize ainda mais este subconjunto definindo um portão específico para células negativas cd38, CD45RA.
Carregue a placa de 384 poços na máquina de fax e classifique células únicas. Se aplicável à máquina de fax, alterne a opção de manter dados de classificação de índices para permitir a retração das células classificadas. Para cultivar HSCs singly ordenado, enrole a placa de cultura 384-well com tampa em plástico de polietileno transparente.
Transfira a placa de 384 poços para uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius com dióxido de carbono de 5% e mantenha-a na incubadora por três a quatro semanas até que os clones visíveis apareçam. Após quatro semanas de cultivo, determine quais poços têm uma confluência de 30% ou mais. Para cada cone, pré-enchimento 1,5 mililitro microtubos com um mililitro de 1%BSA e PBS e rotular o tubo de acordo com o poço correspondente.
Pré-molhar uma ponta de pipeta com 1%BSA e PBS para minimizar o número de células grudadas na ponta da pipeta. Pipeta vigorosamente o meio para cima e para baixo pelo menos cinco vezes enquanto raspa a parte inferior do poço com a pipeta de 200 microliteres fixada em 75 microliters. Colete a suspensão celular no microtubo rotulado que corresponde ao poço.
Repita a tubulação no poço com até 75 microliters de 1%BSA fresco e PBS para garantir a absorção máxima das células. Células clonalmente cultivadas podem ficar no fundo do poço. Inspecione os poços usando um microscópio de luz invertido padrão para garantir se todas as células foram coletadas.
Se todos os poços com maior confluência de 30% forem colhidos, coloque a placa de 384 poços de volta na incubadora. Culturas clonais podem proliferar por até cinco semanas. Gire a suspensão do celular por cinco minutos a 350 vezes g.
Uma pequena pelota deve ser visível. Remova cuidadosamente todos, exceto cerca de cinco microlitrais do supernatante. As pelotas celulares podem ser congeladas a menos 20 graus Celsius e armazenadas por vários meses antes do isolamento do DNA.
Mutações presentes nos primeiros ramos da linha também estarão sub clonalmente presentes na amostra a granel. As linhagens posteriores de ramificação são definidas por mutações compartilhadas apenas entre HSPCs. Para identificar mutações presentes em um subconjunto dos clones e subclonaly presentes no volume, primeiro filtro para mutações somáticas compartilhadas entre clones.
Em um terminal baseado em Unix, edite o filtrosomáticos. ne arquivo para definir os tapinhas e ajustar os outros parâmetros. Execute o filtrosomáticos.
pi script. Filtrar para mutações que estão subclonaly presentes no volume usando o volume determinar lowVAF. r script em um terminal baseado em Unix.
Isso gerará arquivos vcf separados para variantes de nucleotídeos únicos compartilhados e únicos. Determine todas as mutações compartilhadas entre clones que não estão presentes na amostra em massa, sobrepondo todas as posições de mutação. Exclua falsos positivos por inspeção manual usando o Visualizador Genômico Integrativo, IGV abreviado.
Mutações são consideradas falsas quando não estão presentes quando a mutação está presente na germe em todos os clones ou quando presentes em regiões mal mapeadas. Mutações verdadeiras podem ser compartilhadas entre dois clones ou estar subclonaly presente no volume. Reseqüência de todos os loci compartilhados independentemente usando sequenciamento direcionado ou sanger.
Use as mutações compartilhadas para construir uma tabela binária de mutações versus clones sequenciados, com zero indicando que a mutação não está presente e uma indicando presença da mutação. Exatar a tabela binária de mutação como um mapa de calor juntamente com um dendrograma indicando relações de linhagem entre células usando funções baseadas em R. O mapa de calor indica o estado de mutação para cada célula.
Mostrado como um exemplo de saída da análise do número de cópia gerada pelo controle três c para verificar se há alterações no número da cópia. O gráfico de fração de alelo variante criado pela filtragem de variantes de nucleotídeos único, é um histograma de frequências de alelos variantes na amostra. Um pico na parcela de densidade em 0,5 indica que a amostra é clonal.
Retratado aqui é uma análise típica de padrões mutacionais produzindo uma trama de trinucleotídeos de 96. Além da quantificação de diferentes tipos de mutação, a extração de assinaturas também pode ser realizada com esta ferramenta. Mutações compartilhadas entre clones ou presentes em um clone no controle de germes são validadas usando IGV.
Mutações são consideradas verdadeiras quando presentes na amostra e não em altos níveis de frequência de alelo variante na linha germinal. Mutações são consideradas falsas quando não estão presentes no IGV, o que pode acontecer em regiões mal mapeadas. Em outros casos, eventos detectados pela filtragem de variantes de nucleotídeos únicos são variantes germinas perdidas.
O resequenciamento independente de mutações por resequenciamento direcionado é altamente recomendado para essas mutações em clones selecionados. Após a detecção de mutações somáticas compartilhadas entre clones, uma matriz binária é gerada, um mapa de calor é construído contendo células com e sem as mutações compartilhadas A através de M.A árvore de linhagem do desenvolvimento é indicada. Como próximo passo para o meta apresentado aqui, processos mutacionais ativos em células-tronco hemopoiéticas podem ser determinados usando análise de assinatura mutacional.
