בשיטה זו, אנו יכולים לקבוע במדויק את מספר המוטציות בתא גזע hematopoietic יחיד. מוטציות אלה יכולות לשמש לפענוח תהליכים מוטציה ולניתחו שושלת hematopoietic. השיטה שלנו נמנעת משימוש בטכניקות הגברה של גנום שלם על ידי שיבוט תאי הגזע המטופויטיים במבחנה, מה שתוותו שיעורי שגיאה נמוכים יותר והטבות ניתוח במורד הזרם.
הדפוסים המוטציה הקיימים בגנומים של תאי גזע hematopoietic יכול לחשוף את mutagenic ואת תהליכי תיקון DNA שאליו הם נחשפו. התחל הליך זה עם הכנת חומר מדגם וכתמים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, ולאחר מכן להכין 25 מיליליטר של גזע hematopoietic ותא אביה, או מדיום תרבות HSPC. מלאו תרבות תאים 384 היטב צלחת עם 75 microliters של תרבות HSPC בינוני בכל באר.
כדי למנוע אידוי של המדיום בארות החיצוניות, למלא את הבארים החיצוניות עם 75 microliters של מים סטריליים או PBS, ולא להשתמש בארות אלה למיון תאים. מיון נכון של HSPCs של אותות בני קיימא הוא השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה. הגדר שערים עבור מיון HSPC בהתבסס על פקד לא מוכתם ב- 10,000 תאים מהדגימה המוכתמת.
שער תאים בודדים על ידי ציור שער סביב גובה פיזור ליניארי קדימה לעומת שבר שטח פיזור קדימה. השתמש בשבר הבקרה שאינו נגוע כדי לצייר שער עבור שבר השושלת. צייר שערים עבור תאים חיוביים CD34 ואפיין עוד יותר קבוצת משנה זו על-ידי הגדרת שער ספציפי עבור CD38 שלילי, CD45RA תאים שליליים.
טען את לוחית ה- 384 בארות במכונת הפקס ומיין תאים בודדים. אם הדבר ישים עבור מכשיר הפקס, החלף מצב באפשרות לשמור על נתוני מיון אינדקס כדי לאפשר חזרה של התאים ממוינים. לתרבות HSCs ממוינים בנפרד, לעטוף את צלחת התרבות 384 באר עם מכסה לעטוף פוליאתילן שקוף.
מעבירים את צלחת ה-384 היטב לחה 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ולשמור אותו באינקובטור במשך שלושה עד ארבעה שבועות עד שיבוטים גלויים מופיעים. לאחר ארבעה שבועות של פולחן, לקבוע אילו בארות יש confluency של 30% ומעלה. עבור כל חרוט, לפני מילוי 1.5 microtubes מיליליטר עם מיליליטר אחד של 1%BSA ו PBS ולתייג את הצינור על פי הבאר המתאימה.
הרטבה מראש של קצה פיפטה עם 1%BSA ו- PBS כדי למזער את מספר התאים הנדבקים לקצה הפיפיט. במרץ pipette את המדיום למעלה ולמטה לפחות חמש פעמים תוך גירוד החלק התחתון של באר עם פיפטה 200 microliter להגדיר על 75 microliters. לאסוף את ההשעיה התא microtube שכותרתו שמתאים ל הבאר.
חזרו על צינורות באר עם עד 75 מיקרוליטרים של 1%BSA ו-PBS טריים כדי להבטיח ספיגה מקסימלית של תאים. תאים מתורבתים קלונליים יכולים להידבק לתחתית באר. בדוק את בארות באמצעות מיקרוסקופ אור סטנדרטי, הפוך כדי להבטיח אם כל התאים נאספו.
אם נקצרו כל הבארים עם יותר מ־30%, חזרו לאנקובטור 384 בארות. תרבויות שיבוט יכול להתרבות עד חמישה שבועות. סובב את ההשעיה של התא לחמש דקות ב-350 פעמים.
גלולה קטנה צריכה להיות גלויה. הסר בזהירות את כל המיקרוליטרים מלבד חמישה מיקרוליטרים של העל-טבעי. כדורי תא ניתן להקפיא במינוס 20 מעלות צלזיוס ומאוחסן במשך מספר חודשים לפני בידוד DNA.
מוטציות הקיימות בענפים הראשונים של שושלת היוחסין יהיו גם הן קיימות באופן תת-קלוני בדגימה בתפזורת. שושלת הסתעפות מאוחרת יותר מוגדרת על-ידי מוטציות המשותפות בין HSPCs בלבד. כדי לזהות מוטציות הקיימות בתת-קבוצה של השיבוטים ותת-קטגוריות הקיימות בתפזורת, מסנן תחילה למוטציות סומטיות המשותפות לשיבוטים.
במסוף מבוסס Unix, ערוך את הסינוןסומטי. ne כדי להגדיר את טפיחות ולהתאים את הפרמטרים האחרים. הפעל את המסנניםסומטיים.
פאי סקריפט. סנן עבור מוטציות הקיימות בתת-קטגוריה בצובר באמצעות קביעת נפח lowVAF. r סקריפט במסוף מבוסס יוניקס.
פעולה זו תיצור קבצי VCF נפרדים עבור וריאנטים משותפים וייחודיים של נוקלאוטיד יחיד. קבע את כל המוטציות המשותפות בין שיבוטים שאינם קיימים בדגימה בתפזורת, על-ידי חפיפה של כל תנוחות המוטציה. אל תכלול תוצאות חיוביות שגויות על-ידי בדיקה ידנית באמצעות מציג גנומי אינטגרטיבי, IGV מקוצר.
מוטציות נחשבות שקריות כאשר המוטציה קיימת בנבט בכל השיבוטים או כאשר היא קיימת באזורים ממופים בצורה גרועה. מוטציות אמיתיות יכולות להיות משותפות בין שני שיבוטים או להיות נוכחות בתת-קטגוריה בכמויות גדולות. הסר את כל הלוצ'י המשותף באופן עצמאי באמצעות רצף ממוקד או רצף סנגר.
השתמש במוטציות המשותפות כדי לבנות טבלה בינארית של מוטציות לעומת שיבוטים רצפים, כאשר אפס מצביע על כך שהמוטציה אינה קיימת ואחד המציין נוכחות של המוטציה. פלט הטבלה הבינארית של המוטציה כמפת חום יחד עם דנדרוגרמה המציינת קשרי שושלת בין תאים באמצעות פונקציות מבוססות R. מפת החום מציינת מצב מוטציה עבור כל תא.
מוצג כפלט לדוגמה של ניתוח מספר ההעתקה שנוצר על-ידי פקד 3 c כדי לבדוק אם קיימים שינויים במספרי ההעתקה. עלילת שבר אלל הגרסה שנוצרה על-ידי סינון משתנה נוקלאוטייד יחיד, היא היסטוגרמה של תדרי אלל משתנים בדגימה. שיא בחלקת הצפיפות ב-0.5 מצביע על כך שהדגימה משובשת.
מתואר כאן הוא ניתוח דפוסים מוטציה טיפוסי לייצר עלילה trinucleotide 96. בנוסף לכימות של סוגי מוטציות שונים, מיצוי חתימה יכול להתבצע גם עם כלי זה. מוטציות המשותפות בין שיבוטים או נוכחות בשיבוט בבקרת הנבט מאומתות באמצעות IGV.
מוטציות נחשבות נכונות כאשר הן קיימות בדגימה ולא ברמות גבוהות של תדר אלל בחיידק. מוטציות נחשבות שקריות כאשר אינן קיימות ב- IGV, דבר שיכול לקרות באזורים ממופים בצורה גרועה. במקרים אחרים, אירועים שזוהו על ידי סינון משתנה נוקלאוטיד יחיד הם גרסאות נבטים שלא נענו.
resequencing עצמאי של מוטציות על ידי resequencing ממוקד מומלץ מאוד עבור מוטציות אלה שיבוטים נבחרים. לאחר גילוי מוטציות סומטיות משותפות בין שיבוטים, נוצרת מטריצה בינארית, נבנית מפת חום המכילה תאים עם וללא המוטציות המשותפות A דרך M.The עץ השושלת ההתפתחותי מצוין. כשלד הבא עבור המטה המוצג כאן, ניתן לקבוע תהליכים מוטציה הפעילים בתאי גזע המופויטיים באמצעות ניתוח חתימות מוטציה.
