Bu yöntem, nükleotid veya amino asit düzeyinde spesifik T ve B hücrelerinin araştırılmasını sağlar ve böylece lenfosit popülasyonlarındaki dinamik değişiklikleri ve farklı bozukluklardaki çeşitlilik parametrelerini tanımlayabilir. Yeni nesil dizilemenin avantajı, benzersiz T veya B hücre klonlarını tanımlama ve farklı anatomik bölgelerde veya farklı bireylerde izleme yeteneğidir. Bu, çeşitli hastalıklarda yeni biyobelirteçlerin tanımlanması potansiyeline sahiptir.
Bu prosedürü gösteren Naomi Salamon, laboratuvarımdan bir araştırma asistanı. Bağırsak biyopsilerinin sindirimini ve hücre lizizini yaparak başlayın. Bağırsak biyopsilerini taze toplanmış veya negatif 20 veya negatif 80 santigrat derecede depolanmış olarak alın.
Donmuş biyopsi kullanıyorsanız, buzda çözün. Buz üzerinde soğutulmuş steril 1,7 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne 600 mikrolitre çekirdek liziz çözeltisi ekleyin. Daha sonra tüpe bir biyopsi yerleştirin ve 15 ila 30 dakika boyunca 65 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Mililitre başına 20 miligram proteinaz K'den oluşan 17,5 mikrolitre ekleyin ve tüpü hafifçe sallayarak 55 santigrat derecede bir gecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, numunenin beş dakika boyunca oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Kandan DNA izolasyonu için, tüpü iyice karışana kadar hafifçe sallayın.
Daha sonra kanı dokuz mililitre hücre liziz çözeltisi içeren steril 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakikalık bir kuluçka süresi boyunca tüpü birkaç kez ters çevirin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 600g'de santrifüj.
Ardından, görünür beyaz peletin rahatsız edilmeden mümkün olduğunca fazla süpernatant atın. Tüpü tamamen yeniden depolanıncaya kadar 15 saniye boyunca kuvvetlice vorteks edin. Üç mililitre çekirdek liziz çözeltisi ve pipet birkaç kez ekleyerek çözeltinin viskoz hale gelmesine neden olun.
Numuneye protein çökeltme tamponu ekleyin. Sonra 20 saniye boyunca güçlü bir şekilde girdaplayın ve beş dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın. Çökemiş proteinleri içeren sıkı bir pelet oluşturmak için dört dakika boyunca 16.000g'de santrifüj.
Peletin rahatsız edilmeden süpernatant'ı yeni bir 1,7 mililitrelik tüpe dikkatlice aktarın. Süpernatant içeren tüpe bir mililitre 2 propanol ekleyin ve ters çevirerek hafifçe karıştırın. DNA beyaz yüzen bir madde olarak görünür hale gelmelidir.
Bir dakika boyunca 16.000 g'da santrifüj ve süpernatantı tamamen çıkarın. Bir mililitre taze hazırlanmış% 70 etanol ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirin. Oda sıcaklığında bir dakika boyunca 16.000g'de santrifüj edin.
Sonra süpernatant dikkatlice atın. Etanol yıkamayı tekrarlayın. Daha sonra DNA peletini 10 ila 15 dakika boyunca havayla kurumaya bırakın.
DNA'ya 50 mikrolitre ultra saf su ekleyin ve metin el yazmasında açıklandığı gibi DNA nicelemesi gerçekleştirin. Kütüphaneyi sıralamaya hazırlamak için 150 nanogram DNA kullanın. Artık DNA'yı parçalamak için 15 dakika boyunca UV ışıklı kaputun içine pipetler ve uçlar yerleştirin.
Bu arada, farklı indeks tüplerinin ve DNA polimerazlarının buzda çözülmesine izin verin. Biyolojik bir başlıkta, çapraz kontaminasyonu önlemeye dikkat ederek, farklı indeks tüplerinden PCR tüplerine 45 mikrolitre ekleyin. Daha sonra PCR tüplerine 0,2 mikrolitre DNA polimeraz ve hazırlanan DNA'nın beş mikrolitresini ekleyin.
PCR'yi üreticinin talimatlarına göre önceden ayarlanmış bir program kullanarak çalıştırın. Fazla astarların, nükleotitlerin ve enzimlerin uzaklaştırılması için manyetik boncuklar kullanın. Boncukları oda sıcaklığına en az 30 dakika ısıtın ve numune başına 400 mikrolitre için yeterli taze% 80 etanol hazırlayın.
Boncukları her PCR tüpüne ekleyin ve 10 kez pipetleme yaparak karıştırın. Tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Karışık numuneyi beş dakika boyunca manyetik standa yerleştirin.
Sonra berrak sıvıyı epire edin ve atın. Kalan sıvıyı 10 mikroliter ucu kullanarak emiş edin. Her numuneye %80 etanolden oluşan 200 mikrolitre ekleyin ve 30 saniye kuluçkaya yatırın.
195 mikrolitre etanol epire edin ve atın. Daha sonra kalan sıvıyı 10 mikroliter ucu kullanarak aspire edin. Etanol yıkamayı tekrarlayın.
Sonra tüplerin kapaklarını açın ve beş dakika boyunca havayla kurumasına izin verin. Beş dakika sonra, örnekleri manyetik standdan çıkarın ve 25 mikrolitre elution tamponu ekleyin. Homojen olana kadar pipetleme ile karıştırın ve oda sıcaklığında iki dakika kuluçkaya yatırın.
Tüpleri beş dakika boyunca manyetik standa yerleştirin. Daha sonra 22 mikrolitreyi yeni bir PCR tüpüne aktarın ve DNA konsantrasyonu ölçün. Metin el yazmasında açıklandığı gibi amplicon'un ölçülmesi.
Son DNA konsantrasyonunu ve ürünün zirvesinin taban çiftlerindeki boyutu hesaplandıktan sonra, her örnek için yeni bir seyreltme karışımı hazırlayın ve iki mikrolitresini yeni bir havuz karışımına aktarın. 0,2 normal sodyum hidroksit taze bir çözelti hazırlayın ve seyreltilmiş kütüphaneye 10 mikrolitre ekleyin. Çift iplikli DNA'yı yok etmek için oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatır.
Daha sonra kitten DNA içeren tüpe 980 mikrolitre önceden soğutulmuş tampon ekleyin ve kısaca girdap ekleyin. Son kütüphanenin 600 mikrolitresini belirlenen kartuşa yükleyin ve numuneleri makineye yerleştirin. Sıralama çözümlemesi yapmak için sıralayıcıdan sıralama ölçümlerini indirin ve verilerin uygun aralıklarda olduğunu doğrulayın.
Ölçütlere uymayan örnekler için çalıştırmayı yineleyin. Bu protokol, IL10 reseptör eksikliği ve şiddetli infantil başlangıçlı IBD öyküsü olan bir hastanın temsili otolog kan ve rektal örneklerinin temel analizini yapmak için kullanılmıştır. Örnekler hem TCR-beta hem de IGH repertuarı için test edildi.
Tüm klonlar nükleotid veya amino asit seviyesindeki benzersiz dizileriyle tanımlanabilir. Bu diziler, paylaşılan klon arayışındaki farklı hastalar arasında veya aynı hastada farklı anatomik bölgeler arasında karşılaştırılabilir. Her örnek için en sık kullanılan beş klon burada gösterilmiştir.
TreeMap görüntüleri, repertuara geniş bir genel bakış için oluşturulmuştu. Her renkli kare farklı bir klonu temsil eder ve boyut sıklığıyla ilişkilidir. Bu TreeMap görüntüleri bağırsak IGH repertuarında klonal genişleme göstermektedir.
Buna karşılık, TCR-beta repertuarında, otolog bağırsağı ile karşılaştırıldığında kanda belirgin klonal genişleme gözlenir. Gen düzeyinde NGS, gen, aile veya alele düzeyinde V, D ve J kullanımı hakkında bilgi sağlar. Ayrıca, TCR-beta ve IGH repertuarlarının verilerinden belirli VDJ kombinasyonları çıkarılabilir ve çeşitli koşullarda diferansiyel gen kullanım kalıpları ortaya çıkarılabilir.
Bu protokol hem DNA hem de RNA'da uygulanabilir ve TCR-alfa, TCR-gama ve IGL repertuarları oluşturmak için kullanılabilir. Hafif sindirim modifikasyonlarından sonra diğer organlarla da uyumludur.
