Trombositler biyokimyasal ve fizyolojik özellikleri incelenirken kan hücrelerinden ve proteinlerden arındırılmalıdır. Bu nedenle trombositleri fare kanından arındırmak için bir protokol geliştirdik. Bu teknik, trombositlerin iohexol gradyan orta ve düşük hızlı santrifüj kullanarak arındırılması, trombositlerin diğer kan bileşenlerinden net bir şekilde ayrılmasıile sonuçlanabilir.
Trombositleri arındırmak için, 200 mikrolitre taze hasat edilmiş tam kanın 1,5 mililitrelik bir tüpün kenarına, karıştırmadan 600 mikrolitre iohexol gradyan ortama yavaşça inmekten oluşan geniş delikli pipet ucu kullanın. Trombositleri izole etmek için sallanan kova rotorunda santrifüjden sonra, trombosit açısından zengin tabakanın çoğunu ve trombosit fakiri tabakasının küçük bir kısmını beyaz kan hücresi veya kırmızı kan hücresi tabakasını beslemeden toplamak için yeni bir geniş delikli pipet ucu kullanın. Trombosit örneğini yeni bir tüpe ekleyin ve trombositlere bir mililitre PBS ekleyin.
Başka bir santrifüj gerçekleştirmeden önce trombositleri ters çevrilerek karıştırın. Daha sonra hafif pipetleme ile PBS 200 mikrolitre pelet resuspend. Trombosit aktivasyonu için, 100 mikrolitre boyama tamponu içeren yeni bir tüpe altı trombosite 1-2 kez 10 aktarın.
0.4-milimolar GPRP peptid ile desteklenen boyama tampon 100 mikrolitre içeren farklı bir tüp için altı trombosit ler için bir ila iki kez 10 ekleyin. Trombositleri etkinleştirmek için GPRP peptid ile tüpe trombin ekleyin ve her iki tüpe de antikor kokteyli ekleyin. Pozitif kontrol olarak, 0.4-milimolar GPRP peptid içeren bir tüp boyama tampon 100 mikrolitre ye kadar tam kan bir mikrolitre ekleyin ve bu trombositleri etkinleştirmek için trombin ekleyin.
Negatif kontrol olarak, 100 mikrolitreye kadar boyama tamponuna bir mikrolitre tam kan ekleyin. Sonra antikor kokteyli ile her iki kontrol tüpleri leke. Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika sonra, tüp başına taze boyama tampon bir mililitre ile örnekleri yıkayın.
300 mikrolitre taze boyama tamponundaki peletleri yeniden askıya alın. Daha sonra hücre örneklerini ışıktan korunan bireysel akış sitometri analiz tüplerine aktarın. Akış sitometrisi tarafından trombositanaliz etmek için, yeni bir deney oluşturmak ve logaritmik yan dağılım nokta çizimleri karşı logaritmik ileri dağılım oluşturmak.
Voltajları gerektiği gibi ayarladıktan sonra, tek renkli lekeli hücreleri telafi kontrolleri için kaydedin. Şimdi tazminat ve kapıları ayarlamak için yeterli hücreleri elde etmek için pozitif kontrol örneği çalıştırın. Daha sonra her tam kan örneği için 100.000 olay elde edin ve kaydedin ve uygun çizim ve kapıları kullanarak akış sitometri verilerini analiz edin.
Kan yavaş yavaş orta üzerine eklenirse, iohexol gradyan orta ve kan örneği tüp iki ayrı tabaka oluşturacaktır. Santrifüjden sonra, üst, saman renkli tabaka plazma içerir ama bozulmamış kan hücreleri. İkinci, beyazımsı, trombosit açısından zengin tabaka trombositlerin çoğunluğunu içerir.
Üçüncü, şeffaf tabaka trombosit-zayıf tabaka ve doğrudan kırmızı kan hücresi ve beyaz kan hücresi pelet üzerindedir. Tam kan kırmızı kan hücreleri, beyaz kan hücreleri ve yan dağılım nokta arsa karşı bir logaritmik ileri dağılım trombositler farklı popülasyonları sergiler. Saflaştırılmış trombositler, ancak, kırmızı veya beyaz kan hücrelerinin ihmal edilebilir sayıda ayrı bir nüfus göstermektedir.
Tam kan örnekleri Ter119 pozitif kırmızı kan hücresi ve SAFlaştırılmış trombosit örneklerinde neredeyse bulunmayan CD45 pozitif beyaz kan hücresi popülasyonları içerir. İşlenmemiş saflaştırılmış trombositler istirahat durumlarını doğrulayan neredeyse hiç aktivasyon belirteci göstermezken, saflaştırılmış trombin ile tedavi edilen trombositler tipik olarak %71 P-selectin ekspresyonu gösterir. İşlenmemiş saflaştırılmış trombosit örneklerinin mikroskobik değerlendirilmesi trombosit agregasyonu olmadığını ortaya koymaktadır.
Ancak trombositile aktivasyondan sonra trombositler sağlam bir toplama gösterirler ve arınma sonrası canlılıklarını doğrularlar. Katman iohexol orta üzerine dikkatle kan örneği, ve trombosit toplarken, başarılı trombosit arınması için kırmızı kan hücresi ve beyaz kan hücresi katmanları toplamak değil gibi dikkatle aspire emin olun. Bu yöntem diğer türlerden trombosit arınması için de kullanılabilir.
Saflaştırılmış trombositler gen ekspresyonu, aktivasyon, agregasyon, granül salınımı ve yapışma çalışmaları için kullanılabilir.
