Önemli Megakaryosit Progenitor popülasyonlarının izolasyonu, hücre kültüründeki soy hiyerarşisinin moleküler tahliller üzerinde tek hücre seviyesine kadar ince analizini sağlar. Bu protokol, MEP ve MKP popülasyonlarının hücre sıralamaları için verimli bir süreçte, gerekli hayvan sayısını en aza indirerek daha etik bir uygulamayı birleştirir. Kemik için, toplama sekiz ila 12 haftalık bir C57 siyah altı farenin gövdesini% 70 etanol ile püskürtün.
Omurgaya dik olarak cildin beş ila bir santimetrelik bir kesisini yapmak için makas kullanın. Ve deriyi aşağı çekerek tüm vücudun etrafını parçala. Fareyi diseksiyon pedi üzerine yüzüstü yerleştirin, ardından parmakları veya makası açıkta kalan omurga boyunca yukarıdan aşağıya kaydırarak pelvik kemikleri bulun.
İlyak armasını bulmak için, arka uzuvların yakınındaki bel bölgesindeki küçük tümseği tanımlayın. Makası omurgaya paralel, omurlara karşı ve iliak tepe tümseğine yakın yerleştirdikten sonra, omurganın yan tarafındaki kasları pelvik kemiğin üzerinde, makası omurlar boyunca kuyruğa doğru kaydırarak kesmeye devam edin. Daha sonra omurlar ve iliak tepe arasında keserek omurlara mümkün olduğunca yakın kalın.
Ve uzuvları vücuttan ayırmak için kalan kasları kesin. Kopuk uzuvları temiz bir yüzeye aktarın. Vücudun geri kalanını kurumsal yönergelere uygun olarak attıktan sonra, çevredeki dokuyu çıkararak pelvik, femoral ve tibial kemikleri ortaya çıkarmak için neşter ve neşter kullanın.
Uyluk kemiğinin distal ucunu tutmak için önlük kullanın ve eklem etrafındaki kasları bir neşterle hafifçe dilimleyerek femoral başı pelvik kemikten dikkatlice ayırın. Pelvik kemikten kalan kası kazıyın ve femoral başı tutan boşluğun ortasında kesin. İlyumu saklayın ve kemiğin üçgen ince tarafını atın.
Neşter kullanarak, iliyumun etrafındaki artık dokuları çıkarın ve temizlenen kemiği% 2 Yenidoğan Baldır Serumu ile desteklenmiş steril PBS'ye yerleştirin. Daha sonra ayak bileğindeki ayağı bacaktan kesmek için makas kullanın. Kaval kemiğinin alt kısmını asalarla tutarak, kası dizine doğru kazıyın.
Fibulayı atın. Daha sonra neşterle tibial plato boyunca bir kesim yapın ve kaval kemiğini steril PBS% 2 NBCS'ye yerleştirin. Uyluk kemiğinin etrafındaki artık dokuları çıkardıktan sonra, femurun üst tarafını asalarla tutun ve neşter bıçağını diz kapağının tabanına yerleştirin.
Diz kapağını ayırmak için uyluk kemiğine paralel olarak diz kapağına doğru bir kuvvet uygulayın. Daha sonra uyluk kemiğini steril PBS% 2 NBCS'ye yerleştirin. Laminer akış kabininde, kemikleri steril PBS% 2 NBCS ile doldurulmuş steril bir Petri kabına aktarın.
Uyluk kemiğinin başını kesmek için neşter kullanın. Bir mililitrelik şırıngayı steril PBS%2 NBCS ile doldurun ve prize 21 kalibrelik bir iğne takın. Daha sonra beş mililitrelik polipropilen tüpü iki mililitre steril PBS% 2 NBCS ile doldurun.
Uyluk kemiğini uzunlakları tutarak, iğneyi sol oluğa, diz kapağı çıkarıldıktan sonra rotasyon uygulayarak, iğnenin tamamen kemiğe, eğime kadar yerleştirilmesini sağlayın. İğne takıldıktan sonra, iğne ile kemiği iki mililitre PBS% 2 NBCS içeren tüpe aktarın. Daha sonra PBS%2 NBCS'yi şırınnadan kemik temiz olana kadar dağıtın ve aspire edin.
İğneyi uyluk kemiğinden çıkarın ve uyluk kafasının olduğu karşı taraftaki deliğe yerleştirin. Tamponu dağıttıktan ve aspire ettikten sonra kemiği atın. İlyak tepesi ve kaval kemiği için, kemiği tutmak için forseps kullanın ve dönüşü uygulayarak iğneyi hafifçe açık tarafa yerleştirin.
İğnenin tamamen kemiğe, eğime kadar sokulmasını sağlamak. Daha sonra iğne ile kemiği iki mililitre PBS% 2 NBCS içeren tüpe aktarın. PBS%2 NBCS'yi şırınnadan kemik temizlenine kadar dağıtın ve aspire edin.
Tüm hücre süspansiyonunu steril beş mililitre polistiren tüpe yerleştirilen 40 mikron hücreli süzgeç kapağından geçirin ve 500 mikrolitre PBS% 2 NBCS ekleyin. Hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini toplam kemik iliği olarak ayırın. Daha sonra boyama işlemi için buzda saklayın.
Filtrelenmiş süspansiyonu santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatant attıktan sonra, peletin taze hazırlanmış bir birincil antikor kokteylinde, buz üzerinde inkübasyonla birlikte 30 ila 45 dakika boyunca yeniden süzülün. Hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini Lin Gözenekleri Fraksiyonu etiketli steril beş mililitre polistiren tüpe ayırın ve 90 mikrolitre PBS% 2 NBCS ekleyin.
Bu arada, 30 saniye boyunca kapsamlı girdap ile şişede yeniden oluşturarak manyetik tükenme için bir boncuk hazırlayın. Hedef hücre başına iki boncuklara karşılık gelen bir boncuk hacmini beş mililitre polipropilen tüpe aktarın ve mıknatısın üzerine tüp yerleştirerek boncukları PBS% 2 NBCS ile iki kez yıkayın. Yıkama tamponunu steril bir cam pastör pipetle çıkardıktan sonra, boncukları 500 mikrolitre steril PBS% 2 NBCS'de yeniden ıslatın.
Manyetik tükenmenin ilk adımı için, yıkanmış hücrelerin peletine 250 mikrolitre boncuk ekleyin ve buzda beş dakika boyunca hafif karıştırma ile kuluçkaya yatırın. Daha sonra iki mililitre steril PBS% 2 NBCS ekleyin, nazik karıştırma ile ve tüpü iki dakika boyunca mıknatısa yerleştirin. Manyetik olmayan fraksiyonu steril bir cam pastör pipetle toplamaya devam edin.
Ve manyetik tükenmenin ikinci adımı için, kalan 250 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin. Parafinle kapatılmış tüpü dört santigrat derecede 20 dakika boyunca bir tüp silindirine yerleştirin. Daha sonra nazik karıştırma ile iki mililitre steril PBS% 2 NBCS ekleyin.
Ve tüpü mıknatısla iki dakika yerleştirin. Manyetik olmayan fraksiyonu steril bir cam pastör pipet ile etiketli, manyetik olmayan Lin Neg Fraksiyonu etiketli steril bir beş mililitre polipropilen tüpüne toplayın ve metin el yazmasında açıklandığı gibi hücre sıralama megakaryositleri progenitörlerine devam edin. Hücre sıralama için gating stratejisi için, Lin Neg popülasyonunda, C-kitini ifade eden hücreler ve Sca-1 veya CD16/32 antijeninin düşük veya hiç ifade edilemez bir ifadesi seçilir.
Bu popülasyonda MEP, CD150 pozitif ve CD9 dim hücreleri olarak tanımlanır. CD150 pozitif ve CD9 parlak hücreler olarak MKP. Temsili Akış SitometriSi Analizi'nde, MEP ve Mkp olarak tanımlanan hücreler, megakaryositik ve trombosit soylarının CD41a ve CD42c klasik belirteçleri için floresan konjuge antikorlarla etiketlenmiştir.
Her iki belirteç de MKp popülasyonunun hücreleri tarafından ifade edildi ve MEP popülasyonunun hücrelerinin yüzeyinde tespit edildi. Sıralanmış megakaryositlerin DNA içeriği, hücrelerin MEP popülasyonu için çoğunlukla 2n olduğunu göstermiştir. Ve MKp hücrelerinin küçük bir kısmı yabancıdır.
Bu popülasyonlarda daha yüksek ploidy hücreleri önemli ölçüde saptamamıştır. Yarı katı klonojenik tahlillerde hem MEP hem de MKp popülasyonlarında CFU-MK saptanmıştır. BFU-E, MKp popülasyonunda saptanmamış, mep ve CD150 negatif CD9 dim progenitor hücre popülasyonunda saptanmıştır.
Farklılaşmanın üçüncü gününde mikroskobik gözlem, MEP ve MKp'nin esas olarak büyük hücreler olarak tanımlanan megakaryositler ürettiğini göstermektedir. Üç günlük kültürden sonra elde edilen megakaryositler CD41 ve CD42c ekspresyolu kullanılarak tanımlanmıştır ve sırasıyla MEP ve MKp hücre popülasyonlarından üretilen hücrelerin% 54'ünü ve% 82'sini temsil eder. Üretilen megakaryositlerin ploidy'si, MKp popülasyonundan elde edilen megakaryositten daha büyüktü, MEP popülasyonu ile karşılaştırıldığında.
Sadece MKp popülasyonundan elde edilen hücreler, proplatelet emisyonu yeteneğine sahipdi ve bu da MKp popülasyonu için daha gelişmiş bir olgunlaşma aşaması olduğunu düşündürmektedir. Pelvik kemiğin kullanımı, hücre sayısına büyük ölçüde artarken, iki adımlı manyetik tükenme, soy tükenmesinin etkinliğini artırır. Bu protokol, transkriptomik ve proteomik analiz ile birlikte biyogenez uygulayan ilgili mekanizmaları kesinlikle deşifre etmek zorunda kalacak olan tek hücreli MEP ve MKp popülasyonunun sonraki kültürüne izin verir.
