小鼠血液中血小板的纯化

血小板在研究其生化和生理特性时应不含血细胞和蛋白质。因此，我们开发了一种从小鼠血液中净化血小板的协议。该技术可以使用 iohexol 梯度中和低速离心来净化血小板，从而将血小板与其他血液成分明确分离。

要净化血小板，请使用宽孔移液器尖端将200微升新鲜收获的全身血液缓慢地从1.5毫升管的一侧滴到600微升的约电子醇梯度介质上，无需混合。在摆动桶转子中离心以分离血小板后，使用新的宽孔移液器尖端收集大部分血小板富血层和小一部分血小板贫层，而不会吸入白血球或红细胞层。将血小板样品添加到新管中，并在血小板中加入一毫升 PBS。

在进行另一次离心之前，通过反转混合血小板。然后用温和的移液将颗粒重新在 200 微升 PBS 中。对于血小板激活，将1至2倍10转移到6个血小板，将含有100微升染色缓冲液的新管中。

将 1 至 2 倍 10 添加到 6 个血小板中，将含有 100 微升染色缓冲液的不同管中加入，并辅以 0.4 毫摩尔 GPRP 肽。将血栓加入管中，用GPRP肽激活血小板，并将感兴趣的抗体鸡尾酒添加到两个管中。作为一种阳性对照，在含有0.4毫摩尔GPRP肽的管子中加入100微升全血的染色缓冲液，并加入血栓素来激活这些血小板。

作为负对，在多达100微升的染色缓冲液中加入一微升全血。然后用抗体鸡尾酒染色两个控制管。在黑暗中室温下30分钟后，用每管一毫升新鲜染色缓冲液清洗样品。

将颗粒重新填充在 300 微升新鲜染色缓冲液中。然后将细胞样本转移到不受光的单个流式细胞分析管中。要通过流式细胞分析血小板，创建新的实验，并生成对数向前散点与对数侧散点点图。

必要时调整电压后，记录补偿控制的单色染色电池。现在运行正对照样本以获得足够的细胞来调整补偿和闸门。然后获取并记录每个全血样本的10万个事件，并使用适当的绘图和门分析流式细胞仪数据。

如果血液被缓慢地添加到介质上，iohexol梯度介质和血液样本将在管中形成两个单独的层。离心后，顶部的稻草色层包含血浆，但没有完整的血细胞。第二层是白血小板丰富的层，包含大部分血小板。

第三，透明层是血小板贫乏层，直接位于红血球和白血球颗粒的正上方。全血在对数向前散射与侧散点图上表现出不同的红血球、白血球和血小板。然而，纯化血小板显示出一种独特的种群，红血球或白血球的数量可以忽略不计。

全血样本含有Ter119阳性红细胞和CD45阳性白细胞群，这些在纯化血小板样本中几乎不存在。未经处理的纯化血小板几乎不表达任何激活标记，以确认其静止状态，而纯化血栓处理血小板通常表现出71%的P选择表达。未经处理的纯化血小板样品的微观评估显示没有血小板聚集。

然而，使用血栓激活后，血小板表现出强大的聚合，进一步确认其纯化后的可行性，如所证明的。将血液样本小心地层对白细胞介质进行分层，在收集血小板时，一定要小心吸气，不要收集红血球和白细胞层，以成功进行血小板纯化。该方法也可用于其他物种的血小板纯化。

纯化血小板可用于基因表达、活化、聚集、颗粒释放和粘附研究。