Las plaquetas deben estar libres de células sanguíneas y proteínas al estudiar sus propiedades bioquímicas y fisiológicas. Por lo tanto, hemos desarrollado un protocolo para purificar las plaquetas de la sangre del ratón. Esta técnica puede purificar las plaquetas utilizando la centrifugación media y de baja velocidad del gradiente de iohexol, lo que resulta en una separación clara de las plaquetas de otros componentes sanguíneos.
Para purificar las plaquetas, utilice una punta de pipeta de diámetro ancho para colocar 200 microlitros de sangre entera recién cosechada lentamente por el lado de un tubo de 1,5 mililitros en 600 microlitros de medio de gradiente de iohexol sin mezclar. Después de la centrifugación en un rotor de cubo oscilante para aislar las plaquetas, utilice una nueva punta de pipeta de diámetro ancho para recoger la mayor parte de la capa rica en plaquetas y una pequeña fracción de la capa pobre en plaquetas sin aspirar el glóbulo blanco o la capa de glóbulos rojos. Agregue la muestra de plaquetas a un tubo nuevo y agregue un mililitro de PBS a las plaquetas.
Mezclar las plaquetas por inversión antes de realizar otra centrifugación. A continuación, resuspender el pellet en 200 microlitros de PBS con pipeteo suave. Para la activación plaquetaria, transfiera de una a dos veces 10 a las seis plaquetas a un tubo nuevo que contenga 100 microlitros de tampón de tinción.
Añadir de una a dos veces 10 a las seis plaquetas a un tubo diferente que contenga 100 microlitros de tampón de tinción complementado con 0,4 mililitros de péptido GPRP. Añadir trombina al tubo con el péptido GPRP para activar las plaquetas, y añadir el cóctel de anticuerpos de interés a ambos tubos. Como control positivo, agregue un microlitro de sangre entera en hasta 100 microlitros de tampón de tinción en un tubo que contenga 0,4 mililitros de péptido GPRP, y agregue trombina para activar estas plaquetas.
Como control negativo, agregue un microlitro de sangre entera en hasta 100 microlitros de tampón de tinción. A continuación, manche ambos tubos de control con el cóctel de anticuerpos. Después de 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, lave las muestras con un mililitro de tampón de tinción fresca por tubo.
Resuspender los pellets en 300 microlitros de tampón de tinción fresca. A continuación, transfiera las muestras celulares a tubos de análisis de citometría de flujo individuales protegidos de la luz. Para analizar las plaquetas por citometría de flujo, cree un nuevo experimento y genere dispersión logarítmica hacia adelante frente a gráficas de puntos de dispersión lateral logarítmica.
Después de ajustar los voltajes según sea necesario, registre las celdas manchadas de un solo color para los controles de compensación. Ahora ejecute la muestra de control positivo para adquirir suficientes celdas para ajustar la compensación y las puertas. A continuación, adquiera y registre 100.000 eventos para cada muestra de sangre completa, y analice los datos de citometría de flujo utilizando las gráficas y puertas adecuadas.
Si la sangre se añade al medio lentamente, el medio de gradiente de iohexol y la muestra de sangre formarán dos capas separadas en el tubo. Después de la centrifugación, la capa superior de color paja contiene el plasma, pero no las células sanguíneas intactas. La segunda capa, blanquecina, rica en plaquetas contiene la mayoría de las plaquetas.
La tercera capa transparente es la capa pobre en plaquetas y está directamente por encima de los glóbulos rojos y el gránulo de glóbulos blancos. Toda la sangre exhibe poblaciones distintas de glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas en una dispersión logarítmica hacia adelante frente a la gráfica de puntos de dispersión lateral. Las plaquetas purificadas, sin embargo, demuestran una población distinta con un número insignificante de glóbulos rojos o blancos.
Las muestras de sangre entera contienen glóbulos rojos positivos a Ter119 y poblaciones de glóbulos blancos CD45 positivos que están casi ausentes en muestras de plaquetas purificadas. Las plaquetas purificadas no tratadas casi no expresan marcadores de activación que confirmen su estado de reposo, mientras que las plaquetas purificadas tratadas con trombina suelen demostrar una expresión de selección de P del 71%. La evaluación microscópica de muestras de plaquetas purificadas no tratadas no revela ninguna agregación plaquetaria.
Después de la activación con trombina, sin embargo, las plaquetas demuestran una agregación robusta, confirmando aún más su viabilidad después de la purificación como se demostró. Capa de la muestra de sangre cuidadosamente en el medio iohexol, y al recoger las plaquetas, asegúrese de aspirar cuidadosamente como para no recoger los glóbulos rojos y capas de glóbulos blancos para la purificación plaquetaria exitosa. Este método se puede utilizar para la purificación plaquetaria de otras especies, así.
Las plaquetas purificadas se pueden utilizar para estudios de expresión génica, activación, agregación, liberación de gránulos y adhesión.
