Bu test, plazma membran biyolojisi alanındaki önemli soruları ele almak ve hasarlı hücrelerin plazma zarLarını ne kadar verimli bir şekilde yeniden mühürleyebildiğini belirlemek için geliştirilmiştir. Bu teknik, plazma zarının yüksek verim kapasitesinde yeniden sızdırmazlık verimliliğini ölçmek ve plazma membranının yeniden mühürlemeye aracılık eden belirli proteinleri ve buna karşılık gelen yolları belirlemek için kullanılabilir. Steril bir pipet havzasıiçine büyüme orta süspansiyon mililitre başına beşinci HeLa hücrelerine 20 mililitre 2.5 kat 10 ekleyerek başlayın ve hücreleri iyice karıştırmak için 10 mililitre serolojik pipet kullanın.
Daha sonra, 96-iyi düz, net alt, siyah polistiren doku kültürü tedavi plaka triplicate iyi başına hücrelerin 100 mikrolitre tohum için çok kanallı mikropipet kullanın. Tüm deneysel koşullar arasındaki karşılaştırmalar eşdeğer hücre sayılarını gerektirdiğinden, homojen bir hücre dağılımının başarılı bir deneyin anahtarı olduğunu unutmayın. 37 santigrat derece ve %5 CO2'de nemlendirilmiş hücre kültürü kuluçka makinesinde 24 saat kaldıktan sonra, plaka okuyucuyu 37 santigrat dereceye ısıtın ve optik konfigürasyonu monokromatöre, okuma modunu floresana ve okuma türünü kinetik olarak ayarlayın.
Dalga boyu ayarlarının altında, dokuz nanometre uyarma ve 15 nanometre emisyon bandpass'ı seçin. Propidium iyodür kullanarak yapılan tahliller için uyarma ve emisyon dalga boylarını sırasıyla 535 nanometre ve 617 nanometreye ayarlayın. Plaka türü altında, plaka biçimi için 96-wells seçin ve siyah duvar berrakalt plakası karşılık gelen önceden ayarlanmış bir plaka yapılandırması seçin.
Okuma alanı altında, kinetik test boyunca analiz edilecek kuyuları vurgulayın. PMT ve optik altında, okuma başına yanıp söner önceden altı ayarlayın ve alttan okumak için kutuyu işaretleyin. Zamanlama altında, 30 dakikalık kinetik bir çalışma için toplam çalışma süresine sıfır saat 30 dakika ve sıfır saniye girin ve aralık için sıfır saat beş dakika sıfır saniye girin.
Ayarlar bilgilerinde belirtilen ayarları onaylayın ve Tamam'ı tıklatın. Ardından kinetik çalıştırmayı başlatmak için oku'yu tıklatın. Görüntüleme parametrelerini ayarlar modu içinde ayarlamak için, optik yapılandırma için MiniMax'ı, okuma modu için görüntülemeyi ve okuma türü için bitiş noktasını ayarlayın. Dalga boylarının altında, iletilen ışığı ve deneysel uyarma ve emisyon dalga boylarına karşılık gelen uygun floresan kutularını seçin.
Plaka türünü ve okuma alanını sadece gösterildiği gibi ayarlayın ve kuyu alanı ayarı altında, görüntülenecek bir kuyu içindeki site sayısını ayarlayın. GFP için görüntü edinme ayarları altında, görüntü başına 20 milisaniye lik pozlama süresiyle aygıtın tamamını iyi görüntüye göre ayarlayın. İletilen ışık için, sekiz milisaniyelik pozlama süresiyle her kuyunun merkezinin tek bir görüntüsünü elde edin.
Propidium iyodür için, 20 milisaniyelik pozlama süresi ile her kuyunun merkezinde tek bir görüntü elde edin. Ardından ayarlar bilgilerindeki ayarları onaylayın ve Görüntülemeyi başlatmak için Tamam'ı tıklatın ve okuyun. Onarım izin koşulları için yüksek iş lenme floresan bazlı bir test kurmak için, hücreleri her kuyuda 200 mikrolitre 37 derece Santigrat M1 orta ile iki kez yıkayın ve ikinci yıkamayı attıktan sonra 30 mikromolar propidium iyodür ile takviye edilmiş 100 mikrolitre taze 37 derece Santigrat M1 ortamı ekleyin.
Onarım kısıtlayıcı koşullar için, hücreleri bir kez 37 derece Santigrat M2 orta 200 mikrolitre ile iyi başına beş milimolar EGTA ile takviye ve sadece M2 orta 200 mikrolitre ile bir yıkama takip ile yıkayın. İkinci yıkama attıktan sonra, iyi başına 30 mikromolar propidium iyodür ile takviye taze 37 derece Santigrat M2 orta 100 mikrolitre ekleyin. Daha sonra plakayı aktarılan ışık, GFP ve PI'nin altında az önce gösterildiği gibi görüntüleyin.
Plaka görüntülenirken, buz üzerine 96 iyi yuvarlak alt polipropilen mikroplaka yerleştirin ve sadece önceki plaka için gösterildiği gibi plaka yapılın. Onarım izin koşulları için, iyi başına 60 mikromolar propidium iyodür ile desteklenen buz gibi m1 orta 100 mikrolitre ekleyin ve iyi başına 4X listeriolysin O ile veya olmadan buz soğuk M1 100 mikrolitre eklenmesi izledi. Onarım kısıtlayıcı koşullar için, iyi başına 60 mikromolar propidium iyodür ile desteklenen buz gibi m2 orta 100 mikrolitre ekleyin ve iyi başına 4X listeriolysin O ile veya olmadan buz soğuk M2 100 mikrolitre eklenmesi izledi.
Listeriolysin O'nun, birinci plaka buz üzerinde yken ve ikinci plaka hazırlanırken kinetik tözün başlamasından yaklaşık beş dakika önce buz üzerinde uygun deneysel konsantrasyonda hazırlanması zorunludur. İlk plaka görüntüleme bittiğinde, hemen buz üzerinde alüminyum folyo bir levha üzerine plaka aktarın. Beş dakika sonra, toksinin uygun dağılımı için karıştırmadan önce her kuyuda çözeltinin menisküs altına pipet uçlarını ekleyerek, ikinci plakanın her kuyudan 100 mikrolitreyi uygun şekilde soğutulmuş plakaya aktarın.
Toksinin bir dakika lığına ana bilgisayar hücrelerine bağlanmasına izin verin ve spektroflorometre modunu kullanarak kinetik sonrası tetkik için ilk plakayı hemen plaka okuyucuya aktarın. Kinetik tararmanın sonunda, ön kinetik görüntülemede gösterildiği gibi plaka görüntüsünün kinetik sonrası görüntüsünü hemen elde edin. Çekirdek floresan dayalı hücre sayısını belirlemek için, ayarlar altında mikroplaka hücre numaralandırma yazılımı, yeniden analiz seçin ve görüntü analizi ayarlarında, nesneleri bulmak için bir dalga boyu olarak 541 kullanarak ayrık nesne analizi seçin.
Nesneleri bul seçeneğinde, görüntüleri bulma yöntemindeki çizimi kullanın, çekirdekleri seçin ve uygula'yı tıklatın, ardından Tamam'ı tıklatın ve hücre sayma algoritmasını başlatmak için okuyun. GFP ekspresyonu, listeriolysin O tedavisinin varlığında veya yokluğunda propidium iyodür yoğunluğu ölçümlerini engellemez. Propidium iyodin ekspresyonu, kinetik öncesi analize kıyasla HeLA H2B-GFP hücrelerinde GFP floresan yoğunluğunda artış la kanıtlanan GFP floresans yoluyla kanayabilir.
Daha da önemlisi, çekirdeklerin numaralandırmasında yer alan segmentasyon süreci GFP floresansındaki artıştan etkilenmediği için bu geçit hücre sayma işlemini etkilemez. Listeriolysin O yokluğunda, plazma membran bütünlüğü varlığı veya ekstrasellüler kalsiyum yokluğunda sabit kalır, kalsiyum varlığında listeriolysin O tedavi propidium iyodür floresan yoğunluğunda sürekli bir artış ile orta sonuçlar takviye. Ancak ekstrasellüler kalsiyum yokluğunda, propidium iyodür floresansında, membran tekrarsızlığının yokluğunu yansıtan önemli ölçüde daha dik bir artış vardır.
Alternatif olarak, uzak kırmızı floresan ile bir karbocyanin nükleik asit bağlayıcı boya GFP ile spektral örtüşme en aza indirmek için propidium iyodür ikame edilebilir. Buna ek olarak, uzak kırmızı boya için daha büyük uyarma katsayısı gürültü oranı ve onarım izin ve onarım kısıtlayıcı koşullar arasında daha iyi bir çözünürlük için daha yüksek bir sinyal sergiler. Bu yordamı denerken, tüm tüplerin denemeden bir gün önce etiketleilmesi önerilir, çünkü bu sizi deney günündeki tüm reaktif hazırlığına hazırlayacaktır.
Bu yordamı takiben, görüntü sitometrisi gibi diğer yöntemler ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir, örneğin gözenek oluşturan bir gözenek tüm hücrelere eşit şekilde zarar verir veya bazı hücreler diğerlerinden daha duyarlıdır. Bu teknik, geliştirildikten sonra, gözenek boyutunun farklı hücre tiplerinin onarım verimliliği üzerindeki etkilerini araştırmak için bulaşıcı hastalık ve plazma zarı onarımı alanlarında ki araştırmacıların önünü açmıştır.
