Floresan bazlı membran potansiyel testleri, modülatörlerin epitel hücrelerinde endojen olarak eksprese edilen iyon kanalları üzerindeki etkilerini incelemek için sağlam yöntemler sağlar. Kavramın kanıtı olarak, iyi bilinen epitel hücre hatlarındaki iki iyon kanalının işlevini ölçüyoruz. Bu tahlil çok yönlüdür, çünkü iyon kanalı fonksiyonunu ölçmek için eksojen bir kimyasal prob kullanır, bu nedenle genetik olarak kodlanmış problara olan ihtiyacı atlar.
Bu yüksek verimli analizler, küçük molekül modülatörlerinin, kistik fibroz için tedavileri ilerletme potansiyeline sahip iyon kanalları üzerindeki etkilerini tanımlayabilir ve karakterize edebilir. Başlamak için,% 20 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin streptomisin içeren EMEM içeren bir T75 şişesinde kültür Calu-3 ve Caco-2 hücreleri. Hücreler% 80 ila% 100 akıcılığa ulaştıktan sonra ortamı T75 şişesinden aspire edin.
Hücreleri 10 mililitre fosfat tamponlu salin ile nazikçe yıkayın. Daha sonra, hücre monokatmanına% 0.1 EDTA ile 2 mililitre önceden ısıtılmış% 0.25 tripsin ekleyin. Şişeyi yaklaşık beş dakika boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin.
Bu adımda, hücrelerin şişe yüzeyinden kalktığından ve tek hücreli süspansiyona ayrıştığından emin olun. Reaksiyonu nötralize etmek için 8 mililitre kültür ortamı ekleyin. Hücreler% 30 ila% 40 akıcılığa ulaştığında, konik bir tüpte 18.5 mililitre kültür ortamına 1.5 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin ve karıştırın.
Kuyu başına yaklaşık 140.000 hücre elde etmek için 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna bu hücre süspansiyonunun 200 mikrolitresini ekleyin. Tam bir 384 delikli plakayı plakalamak için, kuyu başına yaklaşık 50.000 hücre elde etmek için konik bir tüpteki 17 mililitre kültür ortamına 1 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Karıştırdıktan sonra, her bir oyuğa 50 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.
Ortamı her iki günde bir değiştirin ve hücrelerin aynı anda tüm kuyucuklarda üç ila beş gün içinde% 100 akıcılığa ulaşmasını sağlayın. Fonksiyonel çalışmalardan 24 saat önce ortamı değiştirin. İlk olarak, sodyum içermeyen, klorür içermeyen tampon çözeltisini, metin protokolünde listelenen reaktiflerle hazırlayın.
Reaktifleri doku kültürü sınıfına, çift damıtılmış suya ekleyin. Reaktiflerin gece boyunca oda sıcaklığında karıştırılarak çözünmesine izin verin. Çözelti stabil hale geldikten sonra, damla damla 1 molar NMDG çözeltisi ekleyerek pH'ı 7.4'e ayarlayın.
30 dakika karıştırın ve çözeltinin ozmolaritesini kilogram başına 300 artı veya eksi 5 milimol aralığına ayarlayın. Tampon çözeltisini filtreleyin ve steril şişelerde saklayın. Daha sonra, membran potansiyel boyasının 0.5 miligramını 1 mililitre sodyum içermeyen, klorür içermeyen tamponda çözün ve çözeltiyi 37 santigrat dereceye ısıtın.
Kültür ortamını Calu-3 ve Caco-2 hücre tek katmanlarından çıkarın. 96 delikli plaka için kuyu başına 195 mikrolitre boya çözeltisi ve 384 delikli bir plaka için kuyu başına 95 mikrolitre ekleyin. Hücrelerin boyayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 35 dakika boyunca yüklemesine izin verin.
Daha sonra, 530 nanometrede uyarma ve 560 nanometrede emisyon ile floresan ölçümleri yapın. Başlangıçta, 30 saniyelik aralıklarla beş dakika boyunca sürekli taban çizgisi okumaları yapın. Daha sonra, bir mikromolar'ın nihai Forskolin konsantrasyonunu elde etmek için 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 5 mikrolitre 400 mikromolar Forskolin çözeltisi ekleyin.
384 delikli plaka için, beş mikrolitre 20 mikromolar Forskolin çözeltisi ekleyin. 15 saniyelik aralıklarla ölçümlerle 20 dakika boyunca bir stimülasyon derecesi alın. Daha sonra, 10 mikromolar'ın nihai konsantrasyonunu elde etmek için 96 kuyucuklu plakaya 5 mikrolitre 400 mikromolar CFTR inhibitörü çözeltisi ekleyin.
384 delikli plakaya, 5 mikrolitre 200 mikromolar CFTR inhibitörü ekleyin. 30 saniyelik aralıklarla ölçümlerle 15 dakika boyunca bir inhibisyon okuması yapın. Her bir kuyucuğun floresan yoğunluğu ölçümlerini ölçün ve değerleri elektronik tablo olarak dışa aktarın.
sütun biçiminde, tek tek kuyuları içeren. Forskolin'in neden olduğu değişiklikleri hesaplamak için, 96 delikli plakanın her bir kuyucuğundan bağıl floresan birimi ölçümlerini, taban çizgisi okumasının son floresan yoğunluğu ölçümüne bölün ve bunları grafiklendirin. Forskolin stimülasyonu sırasında başlangıçtan itibaren ölçülen maksimum floresan yoğunluğu olarak tepe tepkilerini ölçün.
CFTR yanıtını ölçmek için bu ölçümü veya eğrinin altındaki alanı kullanın. CFTR fonksiyonu, Caco-2 hücrelerinde Forskolin stimülasyonu sonrası membran depolarizasyonu olarak saptandı. Florür efflux, araç kontrolü olarak DMSO'ya kıyasla floresanda keskin bir artış olarak tespit edildi.
Forskolin stimülasyonundan sonra, floresan sinyali, CFTR inhibitörü ilavesine kadar sürdürüldü, bundan sonra floresan yoğunluğunda hızlı bir düşüş oldu. Bu fenomen hem Caco-2 hem de Calu-3 hücrelerinde tekrarlanabilirdi. CFTR aktivitesi, Forskolin veya DMSO stimülasyonundan sonra floresandaki maksimum değişimdeki fark olarak hesaplandı.
Bireysel noktalar, Forskolin stimülasyonu ve DMSO kontrolü durumunda ortalamadan artı veya eksi 3 standart sapma arasında değişmekte olup, tahlilin tekrarlanabilirliğini göstermektedir. Fonksiyonel yanıtların özgüllüğünü doğrulamak için, bu membran potansiyel tahlilleri, Ussing odası gibi geleneksel elektrofizyolojik yöntemler kullanılarak daha da doğrulanabilir. Bu platform, yüksek verimli modülatör ekranlar ve heterolog ekspresyon sistemleri ile erişilmesi zor birincil dokularda zaman alıcı biyoelektrik ölçümler arasındaki boşluğu doldurabilir.
