Este ensaio foi desenvolvido para abordar questões-chave no campo da biologia da membrana plasmática e para estabelecer como as células danificadas eficientemente podem resear sua membrana plasmática. Esta técnica pode ser usada para medir a eficiência da resseção da membrana plasmática em uma capacidade de alto rendimento e para identificar proteínas específicas e caminhos correspondentes que mediam o resealing da membrana plasmática. Comece adicionando 20 mililitros de uma pipeta sorológica de 2,5 vezes a 5 vezes por mililitro de suspensão média de crescimento em uma bacia de pipeta estéril e use uma pipeta sorológica de 10 mililitros para misturar completamente as células.
Em seguida, use uma micropipette multicanal para semear 100 microliters de células por poço em triplicado em uma placa tratada de tecido de poliestireno preto de 96 poços. Lembre-se que uma distribuição celular homogênea é a chave para um experimento bem sucedido, pois comparações entre todas as condições experimentais requerem contagem de células equivalentes. Após 24 horas na incubadora de cultura celular umidificada a 37 graus Celsius e 5%CO2, pré-aquece o leitor de placas a 37 graus Celsius e define a configuração óptica para monocromático, o modo de leitura para fluorescência, e o tipo de leitura para cinética.
Sob as configurações do comprimento de onda, selecione uma excitação de nove nanômetros e um bandpass de emissão de 15 nanômetros. Para ensaios utilizando iodeto de propídio, coloque os comprimentos de onda de excitação e emissão em 535 nanômetros e 617 nanômetros, respectivamente. Sob o tipo de placa, selecione 96 poços para o formato da placa e selecione uma configuração de placa predefinida correspondente a uma placa inferior clara da parede preta.
Na área de leitura, destaque para os poços que serão analisados ao longo do ensaio cinético. Em PMT e óptica, predefinir os flashes por leitura para seis e verificar a caixa para ler a partir de baixo. Em tempo normal, digite zero horas 30 minutos e zero segundos no tempo total de execução para um ensaio cinético de 30 minutos e digite zero horas cinco minutos e zero segundos para o intervalo.
Confirme as configurações especificadas nas informações de configurações e clique em OK. Em seguida, clique em ler para iniciar a corrida cinética. Para definir os parâmetros de imagem dentro do modo de configurações, defina MiniMax para a configuração óptica, imagem para o modo de leitura e ponto final para o tipo de leitura. Sob comprimentos de onda, selecione a luz transmitida e as caixas de fluorescência apropriadas correspondentes aos comprimentos de onda experimentais excitação e emissão.
Defina o tipo de placa e a área de leitura como apenas demonstrado e sob a configuração da área do poço, defina o número de locais dentro de um poço a ser imageado. Sob as configurações de aquisição de imagem para GFP, defina o dispositivo para imagem do poço inteiro com um tempo de exposição de 20 milissegundos por imagem. Para a luz transmitida, adquira uma única imagem do centro de cada poço com um tempo de exposição de oito milissegundos.
Para iodeto de propidium, adquira uma única imagem no centro de cada poço com um tempo de exposição de 20 milissegundos. Em seguida, confirme as configurações nas informações de configurações e clique em OK e leia para iniciar a imagem. Para configurar um ensaio baseado em fluorescência de alto rendimento para as condições permissivas de reparo, lave as células duas vezes com 200 microliters de 37 graus Celsius M1 médio por poço e adicione 100 microliters de 37 graus Celsius M1 médio suplementado com 30 micromolar de iodeto de propidium depois de descartar a segunda lavagem.
Para reparar condições restritivas, lave as células uma vez com 200 microlitres de 37 graus Celsius M2 médio suplementados com cinco mililitros EGTA por poço seguido por uma lavagem com 200 microliters de M2 médio sozinho. Depois de descartar a segunda lavagem, adicione 100 microliters de 37 graus Celsius M2 médio suplementado com 30 iodeto de propídio micromolar por poço. Em seguida, imagine a placa sob luz transmitida, GFP e PI como apenas demonstrado.
Enquanto a placa está sendo imageda, coloque uma microplacão de polipropileno fundo redondo 96 no gelo e configure a placa como apenas demonstrado para a placa anterior. Para reparar condições permissivas, adicione 100 microliters de meio M1 gelado suplementado com 60 iodeto de propídio micromolar por poço seguido pela adição de 100 microliters de M1 gelado com ou sem listeriolysina 4X O por poço. Para reparar condições restritivas, adicione 100 microliters de meio M2 frio de gelo suplementado com 60 iodeto de propidium micromolar por poço seguido pela adição de 100 microliters de M2 gelado com ou sem listeriolysina 4X O por poço.
É imperativo preparar listeriolysina O na concentração experimental apropriada no gelo aproximadamente cinco minutos antes do início do ensaio cinético quando a placa um está no gelo e a placa dois está sendo preparada. Quando a primeira placa estiver pronta, transfira imediatamente a placa para uma folha de alumínio no gelo. Após cinco minutos, transfira 100 microliters de cada poço da segunda placa para o bem correspondente adequado na primeira placa resfriada, inserindo as pontas da pipeta abaixo do menisco da solução em cada poço antes de ejetar o volume sem misturar para a distribuição adequada da toxina.
Deixe que a toxina se ligue às células hospedeiras por um minuto e transfira imediatamente a primeira placa para o leitor de placas para o ensaio pós-cinético usando o modo espectrômetro. No final do ensaio cinético, adquira imediatamente uma imagem pós-cinética da imagem da placa, como demonstrado para a imagem pré-cinética. Para determinar a contagem de células com base na fluorescência nuclear, no software de enumeração de células microplacas em configurações, selecione a re-análise e, nas configurações de análise de imagem, selecione a análise discreta do objeto usando 541 como comprimento de onda para encontrar objetos.
Dentro da opção encontrar objetos, use o método de localização de imagens, selecione núcleos e clique em aplicar, em seguida, clique em OK e leia para iniciar o algoritmo de contagem de células. A expressão GFP não interfere nas medidas de intensidade de iodeto de propídio na presença ou ausência de tratamento de listeriolysina O. A expressão do iodeto propidium pode sangrar através da fluorescência GFP, como evidenciado por um aumento na intensidade de fluorescência GFP nas células HeLA H2B-GFP no ensaio de imagem pós-cinética em comparação com a análise pré-cinética.
É importante ressaltar, porém, que esse cruzamento não afeta a contagem celular, pois o processo de segmentação envolvido na enumeração dos núcleos não é afetado pelo aumento da fluorescência GFP. Na ausência de listeriolysina O, a integridade da membrana plasmática permanece constante na presença ou ausência de cálcio extracelular, enquanto o tratamento de listeriolysina O na presença de meio suplementado de cálcio resulta em um aumento constante na intensidade de fluorescência de iodida de propidato. Na ausência de cálcio extracelular, no entanto, há um aumento significativamente mais acentuado da fluorescência de iodida de propídio, refletindo a ausência de ressequeling de membrana.
Alternativamente, um corante de ligação nucleigênica de carbocianina com fluorescência no vermelho distante pode ser substituído por iodeto de propidium para minimizar a sobreposição espectral com GFP. Além disso, o maior coeficiente de excitação para o corante vermelho distante apresenta maior relação sinal/ruído e uma melhor resolução entre as condições permissivas de reparo e reparo. Ao tentar este procedimento, recomenda-se rotular todos os tubos um dia antes do experimento, pois isso irá prepará-lo para toda a preparação do reagente no dia do experimento.
Após este procedimento, outros métodos como a citometria de imagem podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como uma toxina formadora de poros danifica todas as células uniformemente ou algumas células são mais suscetíveis do que outras. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores das áreas de doenças infecciosas e reparação de membrana plasmática explorar os efeitos do tamanho dos poros na eficiência de reparo de diferentes tipos celulares.
