Name: rapid, safe, and simple manual bedside nucleic acid extraction for the detection of virus in whole blood samples
Uploaded: 2018-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples at JoVE.com

Biz Susanne Lopes Rasmussen ve Solvej Kolbjørn Jensen teknik yardım ve klinik örnekleri işleme için teşekkürler. Bu proje finansman yenilikçi ilaç girişimi 2 ortak girişim Hibe Sözleşmesi N ° 115843 altında aldı EbolaMoDRAD Konsorsiyumu bir parçasıdır. Bu ortak girişim, Avrupa Birliği'nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı ve EFPIA destek alır.

Biyomedikal Araştırma Etik Komitesi, Başkent Bölgesi onay verdi ve tüm yöntem tanımlamak burada bir inceleme tahlil kalkınma projeleri üzerinde Danimarka yasa uyarınca etik kurul sistemi tarafından muaf.
1. virüs Inactivation ve hızlı NA çıkarma için kan toplama camlı hazırlanması
Dikkat: Bu iletişim kuralı için kullanılan arabellek guanidinium thiocyanate (GITC) ve iyonik olmayan yüzey aktif, tahriş edici içerir. Uygun laboratuvar güvenlik önlemleri almak, bir akış başlığı kullan ve üstesinden eldiven giyerler. Herhangi bir cilt ve göz teması önlemek. Arabellek döküldü, bu karışım zehirli siyanür oluşumuna neden olabilir çünkü kontamine yüzeyi hiç kloramin veya sodyum hipoklorit ("çamaşır suyu" içinde aktif maddeler) ile doğrudan dezenfekte gerekir. Önce emici doku ile dökülen tampon kadar Sil. Daha sonra ve daha sonra su ile % 70 etanol ile yüzeyi temizleyin ve son olarak, kloramin veya sodyum hipoklorit kullanın.
<ol><li>Kan toplama camlı hazırlamak için belirli ticari lizis arabelleği 1.6 mL tüp 25 G x 1 iğne ve 3 mL şırınga kullanarak kapak delme tarafından 4 mL EDTA Vakum tüpün içine enjekte et. Not: vakum tüpü kapağını çıkarmak değil. Vakum muhafaza edilmelidir.</li>
	<li>Camlı oda sıcaklığında arabellek kullanımı kadar içeren depolar. Not: Tüpler onların hazırlık sonra en az 1 yıl boyunca stabildir.</li>
</ol>2. NA çıkarılması için arabellekleri hazırlanması
<ol><li>Arabellekleri bir NA çıkarma için hazırlamak için iki 1,8 mL, iki 4.5 mL ve bir 3,6 mL tüpler bir rafa yerleştirin.</li>
	<li>Ekleme, pipetting, manyetik cam parçacıkları (MGPs) bir temiz 1,8 mL tüp ve bununla MGPs. Resuspend MGP süspansiyon tamamen pipetting önce etiket için 960 µL tarafından. Not: MGPs hızlı tüp alt kısmında toplamak için eğilimindedir.</li>
	<li>Ekleme, pipetting, yıkama arabellek 4 mL ben temiz 4.5 mL tüp tarafından ve WB-1 olarak etiketleyin. Dikkat: Yıkama arabellek ben tahriş edici guanidinium klorür içerir. Uygun laboratuvar güvenlik önlemleri almak, bir akış başlığı kullan ve üstesinden eldiven giyerler. Herhangi bir cilt ve göz teması önlemek.</li>
	<li>Ekleme, pipetting tarafından bir temiz 3.6 mL tüp yıkama arabelleğe II 1,5 mL ve WB-2 etiketleyin.</li>
	<li>Ekleme, pipetting tarafından yıkama arabelleğe III temiz 4.5 mL Tüp 3 mL ve WB-3 etiketleyin.</li>
	<li>Ekleme, pipetting, elüsyon arabelleği için bir temiz 1,8 mL tüp 100 µL tarafından ve EB etiketleyin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında bölünmemeli arabellekleri kullanmak kadar saklamak. Not: Tüpler onların hazırlık sonra en az 1 ay boyunca stabildir.</li>
</ol>3. kan koleksiyonundan işaret ve bir virüs enfeksiyonu olan hastalarda
Dikkat: tam kan hastadan toplarken uygun laboratuvar güvenlik önlemleri almak. Eldiven ve gözlük giymek. Hasta yalıtım modunda ise, Biyogüvenlik seviye 4 yordamları izleyin.
<ol><li>Hastanın intravenöz tam kan toplamak için bir kelebek iğne ile küçük uzantısı boru ve bir kan toplama vakum tüpü lizis/bağlama arabellek içeren kullanın. Hastanın kolunu aşağı doğru bir konumda dinlenme ve kelebek iğne alt toplama tüp getirin. Kelebek iğne hastanın damar içine yerleştirin ve kan toplama vakum tüpü küçük uzantısı ekleyebilirsiniz. Not: Bu geri akış engeller.</li>
	<li>Kan toplama sonra 5 - 10 kez tüp saygısız tüp içeriği karıştırın. Not: otomatik olarak 1.6 mL lizis/bağlama arabellek içeren kan toplama tüp kalan boşlukta nedeniyle toplanan örnek hacmi 1.6 mL olacaktır.</li>
	<li>% 70 etanol kullanarak tüp dýþýna dezenfekte.</li>
	<li>Tüpler, oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya. Not: Protokol burada duraklatıldı ve tam kan toplama tüpler-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C veya 37 ° C en az 1 ay7için saklanabilir.</li>
	<li>Doğrudan Basitleştirilmiş NA ayıklama yönteme geçin.</li>
</ol>4. tam kan çıkarılması NA Basitleştirilmiş
<ol><li>NA lizis/bağlama arabellek inaktive toplanan kandan, mix arındırmak için vakum saygısız tarafından tüp içeriğini el ile 5-10 x tüp.</li>
	<li>Tüpün kapağı dikkatli bir şekilde çıkarın ve boşaltma kapağı.</li>
	<li>MGPs (1 mL) hazırlanan aliquot doğrudan kan toplama tüp içine dökün.</li>
	<li>Yeni bir kapak bir kullanılmayan kan toplama tüp örnek içeren tüpü yerleştirin.</li>
	<li>Bir parmak tüp sıkıca kapalı olduğundan emin olun ve kan toplama tüp el ile 5 - 10 kat saygısız tüp içeriğini karıştırmak için kapağı yerleştirin.</li>
	<li>Tüp manyetik tutucu içinde yerleştirin ve kapağını tüp sıkıca kapalı sağlamak için bir parmak tutmak.</li>
	<li>Tüp ile manyetik sahibi tüm MGPs tüp mıknatıs ile tarafında toplanan emin olmak için el tarafından birkaç kez çevirin. Not: Manyetik tutucu uzun bir mıknatıs ve bir lastik bant ile değiştirilebilir.</li>
	<li>Tüp kapağını kaldırmak ve tek kullanımlık bir pipet kullanarak veya içeriği 50 mL toplama tüp içine dökme tarafından sadece tüp içeriğini atın. Not: 50 mL toplama tüp aerosoller kapaklı tüp kapatarak kaçının.</li>
	<li>WB-1 (4 mL) hazırlanan aliquot doğrudan kan toplama tüp içine dökün.</li>
	<li>Tüp üzerine kapak koyun ve bir parmak tüp sıkıca kapalı sağlamak için kapağını yerleştirin.</li>
	<li>Kapağı güvenli bir şekilde bir parmak ile sıkılır tutmak manyetik sahibinden tüpü çıkarması. Not: bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanarak, sadece lastik bant ve mıknatıs tüp sizden kaldırın.</li>
	<li>MGPs kan toplama tüp el ile 5 - 10 kat lanetleme tarafından resuspend.</li>
	<li>4.6-4.8 olan adımları yineleyin.</li>
	<li>WB-2 (1,5 mL) hazırlanan aliquot doğrudan kan toplama tüp içine dökün.</li>
	<li>Tüp üzerine kapak koyun ve manyetik sahibinden tüpü çıkarması. Not: bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanarak, sadece lastik bant ve mıknatıs tüp sizden kaldırın.</li>
	<li>Bir parmak tüp sıkıca kapalı sağlamak için kapağını yerleştirin.</li>
	<li>MGPs kan toplama tüp birkaç saniye için el ile saygısız resuspend.</li>
	<li>4.6-4.8 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>WB-3 (3 mL) hazırlanan aliquot doğrudan kan toplama tüp içine dökün.</li>
	<li>Tüp üzerine kapak koyun ve manyetik sahibinden tüpü çıkarması. Not: bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanarak, sadece lastik bant ve mıknatıs tüp sizden kaldırın.</li>
	<li>Bir parmak tüp sıkıca kapalı sağlamak için kapağını yerleştirin.</li>
	<li>MGPs kan toplama tüp el ile 5 - 10 kat lanetleme tarafından resuspend.</li>
	<li>4.6-4.8 olan adımları yineleyin.</li>
	<li>EB hazır aliquot dökün (100 µL) doğrudan kan toplama tüp içine.</li>
	<li>Tüp üzerine kapak koyun ve manyetik sahibinden tüpü çıkarması. Not: bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanarak, sadece lastik bant ve mıknatıs tüp sizden kaldırın.</li>
	<li>MGPs EB içinde kan toplama tüp bir parmak ile 5 - 10 kez dokunarak resuspend. Not: Burada protokol duraklatılmış ve tüpler-20 ° C'de depolanan</li>
	<li>Bir damlacık (5-8 µL) resuspended MGPs 1,5 mL tek kullanımlık pipet (herhangi bir aşağı akım tanılama NA amplifikasyon tahlil lamba/RT-lamba veya qPCR/RT-qPCR deneyleri kullanılan gibi) kullanarak aşağı akım NA amplifikasyon tepki karışıma aktarın. Not: NAs MGPs için sopa, aşağı akım NA amplifikasyon tepki MGPs kullandığınızdan emin olun. Kullanmadan önce MGP süspansiyon karıştırın. Karıştırma sonra MGPs tüp alt kısmında toplayacaktır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+Highly+Sensitive+Molecular+Diagnosis+of+Zika+Virus+by+Lateral+Flow+Assays.">Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays.</a> Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).</li><li>Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Diagnostic+Field+Test+for+Point-of-Care+Detection+of+Ebola+Virus+Directly+from+Blood.">Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood.</a> Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).</li><li>Faye, O., Faye, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+deployment+of+a+rapid+recombinase+polymerase+amplification+Ebola+virus+detection+assay+in+Guinea+in+2015.">Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015.</a> Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).</li><li>Yang, M., Ke, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Evaluation+of+a+Rapid+and+Sensitive+EBOV-RPA+Test+for+Rapid+Diagnosis+of+Ebola+Virus+Disease.">Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Smither, S. J., Weller, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buffer+AVL+alone+does+not+inactivate+Ebola+virus+in+a+representative+clinical+sample+type.">Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).</li><li>Byrnes, S., Fan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Portable,+Pressure+Driven,+Room+Temperature+Nucleic+Acid+Extraction+and+Storage+System+for+Point+of+Care+Molecular+Diagnostics.">A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics.</a> Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).</li><li>Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+bedside+inactivation+of+Ebola+virus+for+safe+nucleic+acid+tests.">Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).</li><li>Vinner, L., Fomsgaard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+orthopoxvirus+for+diagnostic+PCR+analysis.">Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis.</a> Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).</li><li>Schmitz, H., K&#246;hler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+clinical+and+laboratory+data+in+two+cases+of+imported+Lassa+fever.">Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever.</a> Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).</li><li>De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+viral+load+at+diagnosis+associates+with+patient+outcome+and+outbreak+evolution.">Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).</li><li>Hasanoglu, I., Guner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+viral+load+in+Crimean+Congo+hemorrhagic+fever.">Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever.</a> Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).</li><li>Biava, M., Colavita, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+rapid+and+sensitive+RT-qPCR+assay+for+the+detection+of+Ebola+Virus.">Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus.</a> Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).</li><li>Fern&#225;ndez-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous-flow,+microfluidic,+qRT-PCR+system+for+RNA+virus+detection.">Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).</li><li>Weller, S. A., Bailey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Biofire+FilmArray+Biothreat+E-test+(v2.5)+for+rapid+identification+of+Ebola+virus+disease+in+heat-treated+blood+samples+obtained+in+Sierra+Leone+and+United+Kingdom.">Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).</li><li>Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+the+GeneXpert+Ebola+Assay+for+Diagnosis+of+Ebola+Virus+Disease+in+Sierra+Leone:+A+Field+Evaluation+Study.">Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study.</a> PLoS Medicine. 13 (3), e1001980 (2016).</li><li>Biocartis. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test. , (2016).</li><li>MPLC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7. , (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu raporda, bir güvenli, hızlı ve basit el ile başucu NA çıkarma yöntemi lizis/bağlama arabellek inaktive tam kan virüs aşağı akım moleküler tespiti için açıklar. Açıklanan NA çıkarma yöntemi doğrudan lizis/bağlama arabellek (Tablo reçetesi)7içeren vakum kan toplama tüplerde toplanan tam kan örnekleri üzerinde gerçekleştirilen için geliştirilmiştir. Bu belirli bir arabellek EBOV7 inaktive ve yöntem kritik bileşenidir. Kan...

Virüs salgını durumlarda hastaların hastane yalıtım wards veya hızlı tanı gerekli olduğunda, sınırlı zaman güvenli, basit ve doğru bakım noktası moleküler tanı hasta bakım ve risk çevreleme için zorunludur. İki son virüs salgınları, Ebola virüsü (EBOV) Batı Afrika'da (2013) ve Güney Amerika (2015), Zika virüs geliştirilmiş bakım noktası moleküler tanı testleri, Ters transkripsiyon döngü-aracılı İzotermik gibi ilgi arttı amplifikasyon (RT-lamba)1,2 ve recombinase polimeraz amplifikasyon (RPA)3,4. RT-lamba ve RPA Basitleştirilmiş örnek hazırlıkları üzerinde gerçekleştirilebilecek hızlı, hassas ve belirli moleküler testlerdir. Zika virüs için RT-lamba Zika virüs olmayan saf tam kan örneklerinde 30 dk1içinde tespit edebilen bir yanal akışı tahlil (LFA), ile birlikte; Ancak, bir risk grubu 4 patojen sınıflandırılır ve çok bulaşıcı, EBOV örnekleri Biyogüvenlik altında ele alınması gerekir 4 (BSL-4) koşulları düzey ve güvenli herhangi bir tanı yöntemleri uygulanmadan önce inaktive olur.
Örnek2,3,4,5, lizis arabellekleri eklenmesi gibi EBOV için Basitleştirilmiş inactivation yöntemleri salgını sırasında kullanılması; Ancak, bu yöntemler ile Laboratuar donanımları, BSL-3 Biyogüvenlik kabinleri, santrifüj, Isıtma blokları ve Pipetler, en azından gibi BSL-4 koşulları altında işlem gerektirir. Bu ekipman yalıtım koğuşlarında ya alan hastaneler mevcut değil normal. Bu zorluğu aşmak için bavul3' te gerçekleştirin teşhis için yapılan girişimleri ve birkaç taşınabilir cihazlar ve makineleri gelişmiş [Örneğin, nükleik asit (NA) çıkarılması için taşınabilir bir aygıta] olmuştur6. Ancak, EBOV-pozitif örnekleri hala bu cihazların kullanılabilmesi için önce inaktive gerekir.
Biz daha önce bir hızlı başucu virüs inactivation yöntemi EBOV7, vaksinia virüs ve ineklerde virüs8 için buna ek olarak bir ticari lizis/bağlama arabellek tarafından sıradan vakum kan toplama tüpler için doğrudan için izin bildirdin hastanın transfer kan inactivation arabellek7içine. Bu doğrudan ve anında inactivation kapalı bir sistem içinde BSL-4 koşullar7gibi herhangi bir sıkı koruma kullanarak örnekleri işleme gereksinimini ortadan kaldırır ve örnekleri normal BSL-2 şartlar altında ele alınabilir. Bu inactivation Yöntem robotlar ve el arıtma kitleri7gibi birkaç NA emme tesisleri ile uyumludur; Ancak, bu yöntemler laboratuvar donanımları, robotlar, santrifüj ve elektrik, her zaman mevcut alan ayarları veya hastane yalıtım wards değil gibi gerektirir.
Bu raporda, bir güvenli, hızlı ve Basitleştirilmiş el ile NA çıkarma yöntemi bir virüs lizis/bağlama arabellek inaktive tam kan içinde sonraki moleküler tespiti için açıklar. NA çıkarma yöntemi bir mıknatıs/manyetik tutucu dışında herhangi bir donanım gerektirmez. Santrifüjler blok veya elektrik Isıtma, NA çıkarma için ihtiyaç vardır. Bu nedenle, bu yöntem ve laboratuvar olanakları üzerinde bağımlı değildir kolayca herhangi bir yere (Örneğin, alan hastaneler, hastane yalıtım Wards veya düşük kaynak ayarları ile) kullanılır. NA çıkarma yöntemi hızlı ve basit ve doğrudan testlerde herhangi bir aşağı akım NA, qPCR, RT-qPCR, lamba veya RT-lamba gibi kullanılabilir. Bu NA çıkarma yöntemi lamba ve taşınabilir bir pil tahrik izotermal aleti ile birleştirildiğinde, başucu tanı kan toplama 40 dk içinde elde edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL)</td><td>Becton Dickinson</td><td>368861</td><td></td></tr><tr><td>Plus Blood Collection</td><td>Becton Dickinson</td><td>362725</td><td></td></tr><tr><td>23G x 1 needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>LUER LOK syringe (3 mL)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309658</td><td></td></tr><tr><td>Butterfly needle with small-bore extension tubing</td><td>J&amp;oslash;rgen Kruuse A/S</td><td>121714</td><td></td></tr><tr><td>1% Virkon</td><td>Nomeco A/S</td><td>849265</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill</td><td>Roche Diagnostics A/S</td><td>03246752001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit</td><td>Roche Diagnostics A/S</td><td>3038505001</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&amp;trade; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>375418</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&amp;trade; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>379189</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&amp;trade; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>379146</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag&amp;trade;-5 Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12303D</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette (3.5 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.010</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;trade; Samco&amp;trade; Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>231</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;trade; Nunc&amp;trade; 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid, safe, and simple manual bedside nucleic acid extraction for the detection of virus in whole blood samples

Hızlı tanı bir enfeksiyonu salgını yönetimi, risk çevreleme ve hasta bakımı için önemlidir. Biz daha önce Ebola virüsü hızlı başucu inactivation güvenli nükleik asit (NA) testleri için kan örnekleme sırasında için bir yöntem bir ticari lizis/bağlayıcı arabelleğe doğrudan vakum kan toplama tüpler içine ekleyerek göstermiştir. Bu başucu inactivation yaklaşımı kullanarak, bir güvenli, hızlı ve Basitleştirilmiş başucu NA çıkarma yöntemi bir virüs lizis/bağlama arabellek inaktive tam kan içinde sonraki tespiti için geliştirdik. NA çıkarma doğrudan kan toplama tüplerde gerçekleştirilir ve hiçbir ekipman veya elektrik gerektirir.
Kan lizis/bağlayıcı arabelleğe toplandıktan sonra içeriği el ile tüp lanetleme tarafından karışık ve karışımı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe. Manyetik cam parçacıkları (MGPs) tüp eklenir ve içeriği el ile toplama tüp saygısız karıştırılır. MGPs sonra bir manyetik tutucu veya bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanarak kan toplama tüp tarafında toplanır. MGPs üç kez yıkanır ve toplama tüp içine doğrudan elüsyon arabellek eklenmesinden sonra NAs qPCR veya izotermal döngü amplifikasyon (lamba), reaksiyon gelen MGPs kaldırılması olmadan gibi NA testler için hazırız. NA çıkarma yöntemi herhangi bir laboratuvar olanakları üzerinde bağımlı değildir ve kolayca herhangi bir yere (Örneğin, alan hastaneler ve hastane yalıtım wards) kullanılır. Bu NA çıkarma yöntemi lamba ve taşınabilir alet ile birleştirildiğinde, bir tanı kan toplama 40 dk içinde elde edilebilir.

Burada sunulan iletişim kuralı basit ve etkili ve geniş lizis/bağlama arabellek inaktive bulaşıcı tam kan örnekleri üzerinde gerçekleştirilen herhangi bir moleküler tahlil için uygulanabilir. Kan inactivation ve NA çıkarma için iş akışı kan toplama camlı7 (Şekil 1A), kan toplama7 (Şekil 1B), ( NA ayıklama hazırlanması da dahil olmak üzere <strong c...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples at JoVE.com

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Burada, bir protokol virüsü inaktive tam kan rapid virüs nükleik asit çıkarılması için mevcut. Çıkarma doğrudan kan toplama tüplerde gerçekleştirilir ve hiçbir ekipman veya elektrik gerektirir. Yöntem ve laboratuvar olanakları üzerinde bağımlı değildir olabilir herhangi bir yere (Örneğin, alan hastanelerde) kullanılır.

Tam kan örneklerinde virüs tespiti için hızlı, güvenli ve basit el ile başucu nükleik asit çıkarma

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

rapid-safe-simple-manual-bedside-nucleic-acid-extraction-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.3K Görüntüleme.  Statens Serum Institut. Burada, bir protokol virüsü inaktive tam kan rapid virüs nükleik asit çıkarılması için mevcut. Çıkarma doğrudan kan toplama tüplerde gerçekleştirilir ve hiçbir ekipman veya elektrik gerektirir. Yöntem ve laboratuvar olanakları üzerinde bağımlı değildir olabilir herhangi bir yere (Örneğin, alan hastanelerde) kullanılır.

Video: Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

Enterovirüs Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Method 1615 Ölçümü. Bölüm III. RT-qPCR Virüs Algılama

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Çevre

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

Nucleocapsids gelen Viral DNA hazırlanması

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. The geometry of the monolith can be adapted for specific pipette tips ranging in volume from 1.0 to 5.0 ml. The large porosity of the monolith enables viscous or complex samples to readily pass through it with minimal fluidic backpressure. Bi-directional flow maximizes residence time between the monolith and sample, and enables large sample volumes to be processed within a single TruTip. The fundamental steps, irrespective of sample volume or TruTip geometry, include cell lysis, nucleic acid binding to the inner pores of the TruTip monolith, washing away unbound sample components and lysis buffers, and eluting purified and concentrated nucleic acids into an appropriate buffer. The attributes and adaptability of TruTip are demonstrated in three automated clinical sample processing protocols using an Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR and STARplus liquid handling robots, including RNA isolation from nasopharyngeal aspirate, genomic DNA isolation from whole blood, and fetal DNA extraction and enrichment from large volumes of maternal plasma (respectively).

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. Consequently, the sample preparation format is compatible with most liquid handling instruments, and can be used for many medium to high-throughput clinical applications and sample types.

Ortak Liquid Handling Robotlar TruTip Teknoloji kullanarak Klinik Örneklerden DNA ve RNA yüksek verimlilik, Otomatik Ekstraksiyon

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Biyomühendislik

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

Nanopore sıralamayı kullanarak tüm kan mRNA sıralaması

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Genetik

Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid impingement-based air sampling devices for efficacious concentration of negatively-charged viruses from bioaerosols. Thus, the resin serves as an additional concentration step in the bioaerosol sampling workflow. Nucleic acid extraction of the viral particles is then performed directly from the anion exchange resin, with the resulting sample suitable for molecular analyses. Further, this protocol describes a custom-built bioaerosol chamber capable of generating virus-laden bioaerosols under a variety of environmental conditions and allowing for continuous monitoring of environmental variables such as temperature, humidity, wind speed, and aerosol mass concentration. The main advantage of using this protocol is increased sensitivity of viral detection, as assessed via direct comparison to an unmodified conventional liquid impinger. Other advantages include the potential to concentrate diverse negatively-charged viruses, the low cost of anion exchange resin (~$0.14 per sample), and ease of use. Disadvantages include the inability of this protocol to assess infectivity of resin-adsorbed viral particles, and potentially the need for the optimization of the liquid sampling buffer used within the impinger.

An anion exchange resin-based method, adapted to liquid impingement-based bioaerosol sampling of viruses is demonstrated. When coupled with downstream molecular detection, the method allows for facile and sensitive detection of viruses from bioaerosols.

Anyon Exchange reçine kullanma Bioaerosols--dan virüs tespiti

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

Teşhis edilmesi için kullanılan ilişkili Viral ve hücresel proteinler Viral DNA'ın arıtma

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from clinical and biological sources. The method is unbiased and universal; it uses random primers for cDNA synthesis and requires no prior knowledge of the viral sequence content. Before library construction, selective RNase H-based digestion is used to deplete unwanted RNA &#8212; including poly(rA) carrier and ribosomal RNA &#8212; from the viral RNA sample. Selective depletion improves both the data quality and the number of unique reads in viral RNA sequencing libraries. Moreover, a transposase-based &#39;tagmentation&#39; step is used in the protocol as it reduces overall library construction time. The protocol has enabled rapid deep sequencing of over 600 Lassa and Ebola virus samples-including collections from both blood and tissue isolates-and is broadly applicable to other microbial genomics studies.

This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

Klinik Örneklerden RNA Virüs tarafsız Derin Sıralama

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

Tıp

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low titers in their host or cannot be mechanically inoculated to another host are difficult to propagate to achieve a greater titer of infectious material. Infected leaves are ground in a mild buffer with optimal pH and ionic composition recommended for purifying most bacilliform Para retroviruses. Urea is used to break up inclusion bodies that trap virions and to dissolve cellular components. Differential centrifugation provides further separation of virions from plant contaminants. Then proteinase K treatment removes the capsids. Then the viral DNA is concentrated and used for next-generation sequencing (NGS). The NGS data are used to assemble contigs which are submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in the generated dataset. In a parallel pipeline, RNA is isolated from infected leaves using a standard column-based RNA extraction method. Then ribosome depletion is carried out to enrich for a subset of mRNA and virus transcripts. Assembled sequences derived from RNA sequencing (RNA-seq) were submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in this dataset. In our study, we identified two related full-length badnavirus genomes in the two datasets. This method is preferred to another common approach which extracts the aggregate population of small RNA sequences to reconstitute plant virus genomic sequences. This latter metagenomic pipeline recovers virus related sequences that are retro-transcribing elements inserted into the plant genome. This is coupled to biochemical or molecular assays to further discern the actively infectious agents. The approach documented in this study, recovers sequences representative of replicating viruses that likely indicate active virus infection.

Here we present a new approach to identify plant viruses with double-strand DNA genomes. We use standard methods to extract DNA and RNA from infected leaves and carry out next-generation sequencing. Bioinformatic tools assemble sequences into contigs, identify contigs representing virus genomes and assign genomes to taxonomic groups.

Ham Virion ayıklama DNA analizi yeni virüs genleri keşfetmek için virüslü yaprakları gelen RNA analizi ile birleştirerek

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food irrigation, washing, etc. The classical fecal bacteria indicator does not always check for the presence of viral pathogens so the detection of viral pathogens and viral indicators is relevant in order to adopt measures of risk mitigation, especially in humanitarian scenarios and in areas where water-borne viral outbreaks are frequent.
At present, several commercial tests allowing the quantification of fecal indicator bacteria (FIB) are available for testing at the point of use. However, such commercial tests are not available for the detection of viruses. The detection of viruses in environmental water samples requires concentrating several liters into smaller volumes. Moreover, once concentrated, the detection of viruses relies on methods such as nucleic acid extraction and molecular detection (e.g., polymerase chain reaction [PCR]-based assays) of the viral genomes.
The method described here allows the concentration of viruses from 10 L water samples, as well as the extraction of viral nucleic acids at the point of use, with simple and portable equipment. This allows the testing of water samples at the point of use for several viruses and is useful in humanitarian scenarios, as well as at any context where an equipped laboratory is not available. Alternatively, the method allows concentrating viruses present in water samples and the shipping of the concentrate to a laboratory at room temperature for further analysis.

Here we present VirWaTest, which is a simple, affordable and portable method for the concentration and detection of viruses from water samples at the point of use.

VirWaTest, su örnekleri virüslerin tespiti için bir nokta-of-kullanım yöntemi

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...