その技術支援と臨床サンプルの処理のスザンヌは軽やかに駆けるラスムッセンと Solvej Kolbjørn ジェンセンに感謝しますこのプロジェクトは、革新的な医学イニシアティブ 2 共同事業助成契約 N ° 115843 下から資金を受けている EbolaMoDRAD コンソーシアムの一部です。この共同事業は、欧州連合のホライゾン 2020年研究とイノベーション プログラムおよび舵からサポートを受け取ります。

生物医学研究倫理委員会、首都圏は、インフォームド コンセントを与えているし、ここで説明したすべてのメソッドは、アッセイ開発プロジェクトに関するデンマークの法律に従って、倫理委員会システムによってレビューから除外されています。
1. ウイルス不活化と急速な NA 抽出真空採血管の準備
注意: このプロトコルに使用されるバッファーには、刺激であるためチオシアン酸 (GITC) および非イオン性界面活性剤が含まれています。適切な研究室安全対策流フードを使用し、それを処理するときは、手袋を着用します。皮膚と眼との接触を避けます。バッファーがこぼれたら、この混合物は有毒なシアン化物の形成につながる可能性がありますので汚染された表面が消毒クロラミンや次亜塩素酸ナトリウム (「漂白剤」の成分) を直接決してする必要があります。最初、吸収性組織とこぼれたバッファーを拭いてください。次に、70% のエタノールと水の表面をきれいにし最後に、クロラミンまたはナトリウム次亜塩素酸を使用します。
<ol><li>血液コレクション真空管を準備するには、25 x 1 針と 3 mL シリンジを使用してチューブの蓋を貫通して 4 mL EDTA 真空管に特定商業換散バッファーの 1.6 mL を注入します。 注: は、真空管式のふたを削除しないでください。真空を維持する必要があります。</li>
	<li>真空管を使用するまで室温でバッファーを含むを保存します。 注: 少なくとも 1 年間の準備の後のチューブは安定しています。</li>
</ol>2. NA 抽出バッファーの準備
<ol><li>NA 抽出バッファーを準備するには、ラックに 2 つ 1.8 mL、2 4.5 mL および 1 つの 3.6 mL チューブを配置します。</li>
	<li>磁性ガラス粒子 (MGPs) きれいな 1.8 mL チューブ、MGPs。 それと再懸濁します MGP サスペンション完全にそれをピペッティングする前にラベルの 960 μ L をピペットで追加します。 注: MGPs は、管の下部を迅速に収集する傾向があります。</li>
	<li>追加、ピペッティング、4 mL の洗浄バッファー私きれいな 4.5 mL 管によっておよび WB 1 としてラベルを付けます。 注意: 洗浄バッファー私は刺激性であるため塩化物を含んでいます。適切な研究室安全対策流フードを使用し、それを処理するときは、手袋を着用します。皮膚と眼との接触を避けます。</li>
	<li>洗浄バッファー II きれいな 3.6 mL チューブ 1.5 mL をピペットで追加し、WB 2 としてラベルを付けます。</li>
	<li>きれいな 4.5 mL の管に洗浄バッファー III の 3 mL をピペットで追加し、WB 3 としてラベルを付けます。</li>
	<li>きれいな 1.8 mL チューブに溶出バッファーの 100 μ L をピペットで追加し、EB としてラベルを付けます。</li>
	<li>使用するまで室温で検体のバッファーを格納します。 注: チューブは、最低 1 ヶ月の準備期間を経て安定しました。</li>
</ol>3. ウイルス感染の徴候と症状を持つ患者からの採血
注意: は、患者から全血を収集するときに適切な研究室安全措置を講じます。手袋、眼鏡を着用します。患者は単独では、バイオ セーフティ レベル 4 の手順に従ってください。
<ol><li>患者から静脈全血を収集するには、小口径の延長チューブと蝶針と換/結合バッファーを含む血液コレクション真空管を使用します。下方の位置に患者の腕を置き、コレクション チューブ蝶針よりも下の位置します。蝶針を患者の静脈に挿入し、血液コレクション真空管を小口径拡張に添付します。 注: これは逆流を防ぐ。</li>
	<li>血液採取後 5-10 回チューブを反転して管の内容をミックスします。 注: 1.6 mL の溶解/結合バッファーを含む血のコレクションの管に残りの掃除により採取された試料の量自動的に 1.6 mL。</li>
	<li>70% のエタノールを使用してチューブの外側を消毒します。</li>
	<li>室温で 20 分間チューブを孵化させなさい。 注: プロトコルをここで一時停止することができます、完全な血のコレクションの管は-20 ° C、5 ° C、25 ° C または少なくとも 1 月7の 37 ° C で保存できます。</li>
	<li>簡体字の NA 抽出方法に直接進みます。</li>
</ol>4. 全血中の NA 抽出の簡略化
<ol><li>換/結合バッファー不活化収集した血液、ミックスから NA を浄化するために真空を反転による管の内容管手で 5-10 倍です。</li>
	<li>慎重にチューブの蓋を取り外し、蓋を放電します。</li>
	<li>血のコレクションの管に直接 MGPs (1 mL) の準備の因数を注ぐ。</li>
	<li>サンプルを格納筒、未使用採血管から新しいふたを配置します。</li>
	<li>チューブがしっかり閉じていることを確認し、採血管をひっくり返すこと手で 5-10 倍管の内容をミックスする蓋の上に指を置きます。</li>
	<li>マグネット ホルダーにチューブを置き、指を離さないように、管を密閉蓋。</li>
	<li>マグネット チューブの側ですべての MGPs を収集できるように手で数回チューブ マグネット ホルダーを反転します。 注: マグネット ホルダーは細長い磁石とゴムバンドで置き換えることができます。</li>
	<li>チューブの蓋を取り外し、使い捨てのピペットを使用するか、コレクション、50 mL のチューブに内容を注ぐことによって単に管の内容を破棄します。 注: は、ふた付き管を閉じることにより 50 mL コレクションの管からのエアロゾルを回避します。</li>
	<li>血のコレクションの管に直接 WB 1 (4 mL) の準備の因数を注ぐ。</li>
	<li>チューブのふたを閉めてチューブをしっかり閉じていることを確認するための蓋の上に指を置きます。</li>
	<li>指でしっかり蓋をしながら、マグネット ホルダーからチューブを削除します。 注: 場合磁石、ラバー バンドを使用して、単に削除ゴムバンドとマグネット チューブから。</li>
	<li>手で 5 ~ 10 回の血のコレクションの管をひっくり返すこと、MGPs を再懸濁します。</li>
	<li>4.6 4.8 の手順を繰り返します。</li>
	<li>血のコレクションの管に直接 WB 2 (1.5 mL) の準備の因数を注ぐ。</li>
	<li>チューブの蓋を置き、マグネット ホルダーからチューブを取り外します。 注: 場合磁石、ラバー バンドを使用して、単に削除ゴムバンドとマグネット チューブから。</li>
	<li>チューブをしっかり閉じていることを確認するための蓋の上に指を置きます。</li>
	<li>数秒間血のコレクションの管を手で弾くことによって、MGPs を再懸濁します。</li>
	<li>4.6 4.8 のステップを繰り返します。</li>
	<li>血のコレクションの管に直接 WB 3 (3 mL) の準備の因数を注ぐ。</li>
	<li>チューブの蓋を置き、マグネット ホルダーからチューブを取り外します。 注: 場合磁石、ラバー バンドを使用して、単に削除ゴムバンドとマグネット チューブから。</li>
	<li>チューブをしっかり閉じていることを確認するための蓋の上に指を置きます。</li>
	<li>手で 5 ~ 10 回の血のコレクションの管をひっくり返すこと、MGPs を再懸濁します。</li>
	<li>4.6 4.8 の手順を繰り返します。</li>
	<li>理事会の準備の因数を注ぐ (100 μ L) 血のコレクションの管に直接。</li>
	<li>チューブの蓋を置き、マグネット ホルダーからチューブを取り外します。 注: 場合磁石、ラバー バンドを使用して、単に削除ゴムバンドとマグネット チューブから。</li>
	<li>5-10 回指で採血管を叩くことによって理事会で、MGPs を再懸濁します。 注: プロトコルがここでは、一時停止にできるし、チューブが-20 ° C で保存できます。</li>
	<li>再懸濁 mgps 1.5 mL 使い捨てピペット (任意の下位診断 NA 増幅分析などランプ/RT-ランプまたは qPCR/Rt-qpcr アッセイを使用できます) を使用して、ダウン ストリーム NA 増幅反応混合物に 1 つの液滴 (5-8 μ L) を転送します。 注: NAs が、MGPs に固執するので、必ず下流 NA 増幅反応で、MGPs を使用します。使用する前に MGP サスペンションをミックスします。混合した後、管の下部に、MGPs を収集します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+Highly+Sensitive+Molecular+Diagnosis+of+Zika+Virus+by+Lateral+Flow+Assays.">Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays.</a> Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).</li><li>Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Diagnostic+Field+Test+for+Point-of-Care+Detection+of+Ebola+Virus+Directly+from+Blood.">Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood.</a> Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).</li><li>Faye, O., Faye, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+deployment+of+a+rapid+recombinase+polymerase+amplification+Ebola+virus+detection+assay+in+Guinea+in+2015.">Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015.</a> Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).</li><li>Yang, M., Ke, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Evaluation+of+a+Rapid+and+Sensitive+EBOV-RPA+Test+for+Rapid+Diagnosis+of+Ebola+Virus+Disease.">Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Smither, S. J., Weller, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buffer+AVL+alone+does+not+inactivate+Ebola+virus+in+a+representative+clinical+sample+type.">Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).</li><li>Byrnes, S., Fan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Portable,+Pressure+Driven,+Room+Temperature+Nucleic+Acid+Extraction+and+Storage+System+for+Point+of+Care+Molecular+Diagnostics.">A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics.</a> Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).</li><li>Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+bedside+inactivation+of+Ebola+virus+for+safe+nucleic+acid+tests.">Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).</li><li>Vinner, L., Fomsgaard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+orthopoxvirus+for+diagnostic+PCR+analysis.">Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis.</a> Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).</li><li>Schmitz, H., K&#246;hler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+clinical+and+laboratory+data+in+two+cases+of+imported+Lassa+fever.">Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever.</a> Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).</li><li>De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+viral+load+at+diagnosis+associates+with+patient+outcome+and+outbreak+evolution.">Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).</li><li>Hasanoglu, I., Guner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+viral+load+in+Crimean+Congo+hemorrhagic+fever.">Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever.</a> Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).</li><li>Biava, M., Colavita, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+rapid+and+sensitive+RT-qPCR+assay+for+the+detection+of+Ebola+Virus.">Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus.</a> Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).</li><li>Fern&#225;ndez-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous-flow,+microfluidic,+qRT-PCR+system+for+RNA+virus+detection.">Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).</li><li>Weller, S. A., Bailey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Biofire+FilmArray+Biothreat+E-test+(v2.5)+for+rapid+identification+of+Ebola+virus+disease+in+heat-treated+blood+samples+obtained+in+Sierra+Leone+and+United+Kingdom.">Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).</li><li>Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+the+GeneXpert+Ebola+Assay+for+Diagnosis+of+Ebola+Virus+Disease+in+Sierra+Leone:+A+Field+Evaluation+Study.">Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study.</a> PLoS Medicine. 13 (3), e1001980 (2016).</li><li>Biocartis. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test. , (2016).</li><li>MPLC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7. , (2015).</li></ol>

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本報告で述べる安全、迅速かつ簡単なマニュアル ベッドサイド NA 抽出換/結合バッファー不活化全血中のウイルスの下流分子検出のため。換/結合バッファー (材料表)7を含む真空採血管で収集された全血サンプルで直接実行するのに記載されている NA 抽出法が開発されました。この特定のバッファー EBOV7を不活性化し、メソッドの重要なコン?...

ウイルスの発生状況は、患者が隔離病棟または迅速な診断が必要な場合に限られているとき、安全で簡単、かつ正確なポイント ・ オブ ・ ケアの分子診断は患者のケアとリスクの封じ込めのため不可欠です。2 つウイルスの最近の発生、エボラ出血熱ウイルス (EBOV) 西アフリカ (2013)、南アメリカ (2015)、ジカの改善ポイント ・ オブ ・ ケアの診断テスト分子、逆のトランスクリプションのループを介した等温などに対する関心が高まってください。増幅 (RT ランプ)1,2編シュプリンガー ・ ポリメラーゼ増幅 (RPA)3,4。RT ランプ、RPA は、簡単なサンプル準備を行うことが急速な敏感な特定の分子テストです。ジカ ウイルスの RT ランプは 30 分1; 内非精製の全血試料中ジカ ウイルスを検出することができます側方流動試金 (LFA) と結合されていますただし、リスク グループ 4 病原体として分類される、非常に伝染性、EBOV のサンプルは、バイオ セーフティの下で処理する必要がある 4 (BSL-4) 条件、任意の安全な診断手順を実行前に不活化します。
EBOV、3,2,54,サンプル、換散バッファーの追加など簡略化された不活化方法が発生; 中に使用されました。ただし、これらのメソッドには、BSL 3 バイオ セーフティ キャビネット、遠心分離機、加熱ブロック、最低、ピペットなどの実験装置と BSL 4 条件下で処理が不要です。病棟別や野戦病院でこの装置は通常ありません。このような課題を克服するために、スーツケース3診断を実行する試みがなされ、いくつかのポータブル デバイスとマシンを開発 [例えば核酸 (NA) 抽出のためのポータブル デバイス] されている6。ただし、この EBOV 肯定的なサンプルは、これらのデバイスを使用することができます前に不活化する必要があります。
について報告した急速なベッドサイド ウイルス不活化法による EBOV7、ワクシニア ウイルス、牛痘ウイルス8商業換/結合バッファーの添加による普通の真空採血管に直接を可能にします。患者から不活化バッファー7へ血液の転送。クローズド システムのこの直接および即時の不活化 BSL 4 条件7など、厳密な包含を使用してサンプルを処理する必要がある、通常の BSL 2 条件下でサンプルを処理できます。この不活化方法はロボットや手浄化キット7など、いくつかの NA 抽出システムとの互換性ただし、これらのメソッドには、実験装置、ロボット、遠心分離機、や電気のフィールドの設定または隔離病棟内存在とは限らないなどが必要があります。
本報告で述べる安全・迅速かつ簡易マニュアル NA 抽出換/結合バッファー不活化全血中のウイルスのそれに続く分子検出のため。NA の抽出法では、マグネット ・ マグネット ホルダー以外の装備は必要ありません。NA を抽出するための遠心分離機、ブロック、または電気暖房は不要です。したがって、このメソッドは実験施設に依存しないとすることができます簡単に任意の場所 (例えば、野戦病院、病棟の分離または低リソースの設定で) 使用します。NA 抽出法は、迅速かつ簡単な qPCR、RT qPCR、ランプ、または RT ランプなどのすべてのダウン ストリーム NA テストで直接使用することができます。この NA 抽出法をランプとポータブル バッテリー駆動の恒温器と組み合わせれば、血液のコレクション 40 分内ベッドサイド診断を取得できます。

<table><tbody><tr><td>Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL)</td><td>Becton Dickinson</td><td>368861</td><td></td></tr><tr><td>Plus Blood Collection</td><td>Becton Dickinson</td><td>362725</td><td></td></tr><tr><td>23G x 1 needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>LUER LOK syringe (3 mL)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309658</td><td></td></tr><tr><td>Butterfly needle with small-bore extension tubing</td><td>J&amp;oslash;rgen Kruuse A/S</td><td>121714</td><td></td></tr><tr><td>1% Virkon</td><td>Nomeco A/S</td><td>849265</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill</td><td>Roche Diagnostics A/S</td><td>03246752001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit</td><td>Roche Diagnostics A/S</td><td>3038505001</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&amp;trade; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>375418</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&amp;trade; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>379189</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&amp;trade; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>379146</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag&amp;trade;-5 Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12303D</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette (3.5 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.010</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;trade; Samco&amp;trade; Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>231</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;trade; Nunc&amp;trade; 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid, safe, and simple manual bedside nucleic acid extraction for the detection of virus in whole blood samples

アウトブレイク管理、リスクの抑制、および患者のケアのための感染症の迅速診断が欠かせません。以前、真空採血管に直接商業換/結合バッファーを追加することによって安全な核酸 (NA) テストのための血液採取中にエボラ ウイルスの急速なベッドサイド不活性化する方法を示しました。このベッドサイド不活化アプローチを使用して、我々 手法を開発した安全、迅速かつ簡単なベッドサイド NA 抽出換/結合バッファー不活化全血中のウイルスの後続の検出。NA の抽出は、採血管で直接実行され、機器や電気を必要としません。
換/結合バッファーには採血後チューブを手で弾くことによってのコンテンツが混在し、混合物は室温で 20 分間インキュベートします。チューブに磁性ガラス粒子 (MGPs) が追加され、コレクション チューブを手で弾くことによってのコンテンツが混在します。ゴムや磁石マグネット ホルダーを使用して、採血管の側面に、MGPs を収集します。MGPs 3 回洗浄し、コレクションの管に直接溶出バッファーの追加により、NAs NA 試験、qPCR 反応から MGPs を取り外すことがなく等温ループ増幅 (ランプ) などの準備が整います。NA の抽出法があらゆる所に依存しないと簡単にすることができます (例えば、野戦病院の隔離病棟) どこでも使用されます。この NA 抽出法をランプとポータブル機器と組み合わせれば、血液のコレクション 40 分以内で診断が可能です。

ここで提示されたプロトコルは単純で効率的と換/結合バッファーで不活化感染全血サンプルで実行される任意の分子アッセイに広く適用できます。血の不活性化および NA 抽出のワークフローはに示す図 1血コレクション真空管7 (図 1 a)、血液コレクション7 (図 1 b)?...

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Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

ここでは、ウイルス不活化全血から急速なウイルス核酸抽出のためのプロトコルを提案する.抽出は、採血管に直接行い機器や電気を必要としません。メソッドは実験施設に依存しないとすることができます (例えば、野戦病院で) どこでも使用されます。

迅速・安全・簡易マニュアル ベッドサイド核酸抽出の全血試料中のウイルス検出

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

rapid-safe-simple-manual-bedside-nucleic-acid-extraction-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.3K ビュー.  Statens Serum Institut. ここでは、ウイルス不活化全血から急速なウイルス核酸抽出のためのプロトコルを提案する.抽出は、採血管に直接行い機器や電気を必要としません。メソッドは実験施設に依存しないとすることができます (例えば、野戦病院で) どこでも使用されます。

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EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

エンテロウイルスと文化およびRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。パートIII。 RT-qPCRによりウイルス検出

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

環境学

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

ヌクレオカプシドからウイルスDNAの調製

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

免疫・感染学

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. The geometry of the monolith can be adapted for specific pipette tips ranging in volume from 1.0 to 5.0 ml. The large porosity of the monolith enables viscous or complex samples to readily pass through it with minimal fluidic backpressure. Bi-directional flow maximizes residence time between the monolith and sample, and enables large sample volumes to be processed within a single TruTip. The fundamental steps, irrespective of sample volume or TruTip geometry, include cell lysis, nucleic acid binding to the inner pores of the TruTip monolith, washing away unbound sample components and lysis buffers, and eluting purified and concentrated nucleic acids into an appropriate buffer. The attributes and adaptability of TruTip are demonstrated in three automated clinical sample processing protocols using an Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR and STARplus liquid handling robots, including RNA isolation from nasopharyngeal aspirate, genomic DNA isolation from whole blood, and fetal DNA extraction and enrichment from large volumes of maternal plasma (respectively).

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. Consequently, the sample preparation format is compatible with most liquid handling instruments, and can be used for many medium to high-throughput clinical applications and sample types.

共通液ハンドリングロボットでTruTipテクノロジーを使用して臨床検体からのDNAやRNAのハイスループット、自動抽出

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

生物工学

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

ナノポアシーケンシングを用いた全血からの mRNA の配列決定

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

遺伝学

Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid impingement-based air sampling devices for efficacious concentration of negatively-charged viruses from bioaerosols. Thus, the resin serves as an additional concentration step in the bioaerosol sampling workflow. Nucleic acid extraction of the viral particles is then performed directly from the anion exchange resin, with the resulting sample suitable for molecular analyses. Further, this protocol describes a custom-built bioaerosol chamber capable of generating virus-laden bioaerosols under a variety of environmental conditions and allowing for continuous monitoring of environmental variables such as temperature, humidity, wind speed, and aerosol mass concentration. The main advantage of using this protocol is increased sensitivity of viral detection, as assessed via direct comparison to an unmodified conventional liquid impinger. Other advantages include the potential to concentrate diverse negatively-charged viruses, the low cost of anion exchange resin (~$0.14 per sample), and ease of use. Disadvantages include the inability of this protocol to assess infectivity of resin-adsorbed viral particles, and potentially the need for the optimization of the liquid sampling buffer used within the impinger.

An anion exchange resin-based method, adapted to liquid impingement-based bioaerosol sampling of viruses is demonstrated. When coupled with downstream molecular detection, the method allows for facile and sensitive detection of viruses from bioaerosols.

陰イオン交換樹脂を用いるバイオエアロゾルからのウイルスの検出

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from clinical and biological sources. The method is unbiased and universal; it uses random primers for cDNA synthesis and requires no prior knowledge of the viral sequence content. Before library construction, selective RNase H-based digestion is used to deplete unwanted RNA &#8212; including poly(rA) carrier and ribosomal RNA &#8212; from the viral RNA sample. Selective depletion improves both the data quality and the number of unique reads in viral RNA sequencing libraries. Moreover, a transposase-based &#39;tagmentation&#39; step is used in the protocol as it reduces overall library construction time. The protocol has enabled rapid deep sequencing of over 600 Lassa and Ebola virus samples-including collections from both blood and tissue isolates-and is broadly applicable to other microbial genomics studies.

This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

臨床サンプルからのRNAウイルスの公平なディープシーケンシング

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

医学

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low titers in their host or cannot be mechanically inoculated to another host are difficult to propagate to achieve a greater titer of infectious material. Infected leaves are ground in a mild buffer with optimal pH and ionic composition recommended for purifying most bacilliform Para retroviruses. Urea is used to break up inclusion bodies that trap virions and to dissolve cellular components. Differential centrifugation provides further separation of virions from plant contaminants. Then proteinase K treatment removes the capsids. Then the viral DNA is concentrated and used for next-generation sequencing (NGS). The NGS data are used to assemble contigs which are submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in the generated dataset. In a parallel pipeline, RNA is isolated from infected leaves using a standard column-based RNA extraction method. Then ribosome depletion is carried out to enrich for a subset of mRNA and virus transcripts. Assembled sequences derived from RNA sequencing (RNA-seq) were submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in this dataset. In our study, we identified two related full-length badnavirus genomes in the two datasets. This method is preferred to another common approach which extracts the aggregate population of small RNA sequences to reconstitute plant virus genomic sequences. This latter metagenomic pipeline recovers virus related sequences that are retro-transcribing elements inserted into the plant genome. This is coupled to biochemical or molecular assays to further discern the actively infectious agents. The approach documented in this study, recovers sequences representative of replicating viruses that likely indicate active virus infection.

Here we present a new approach to identify plant viruses with double-strand DNA genomes. We use standard methods to extract DNA and RNA from infected leaves and carry out next-generation sequencing. Bioinformatic tools assemble sequences into contigs, identify contigs representing virus genomes and assign genomes to taxonomic groups.

新しいウイルスのゲノムを発見する感染葉からの RNA の解析とウイルス粒子粗抽出 DNA の結合解析

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food irrigation, washing, etc. The classical fecal bacteria indicator does not always check for the presence of viral pathogens so the detection of viral pathogens and viral indicators is relevant in order to adopt measures of risk mitigation, especially in humanitarian scenarios and in areas where water-borne viral outbreaks are frequent.
At present, several commercial tests allowing the quantification of fecal indicator bacteria (FIB) are available for testing at the point of use. However, such commercial tests are not available for the detection of viruses. The detection of viruses in environmental water samples requires concentrating several liters into smaller volumes. Moreover, once concentrated, the detection of viruses relies on methods such as nucleic acid extraction and molecular detection (e.g., polymerase chain reaction [PCR]-based assays) of the viral genomes.
The method described here allows the concentration of viruses from 10 L water samples, as well as the extraction of viral nucleic acids at the point of use, with simple and portable equipment. This allows the testing of water samples at the point of use for several viruses and is useful in humanitarian scenarios, as well as at any context where an equipped laboratory is not available. Alternatively, the method allows concentrating viruses present in water samples and the shipping of the concentrate to a laboratory at room temperature for further analysis.

Here we present VirWaTest, which is a simple, affordable and portable method for the concentration and detection of viruses from water samples at the point of use.

水サンプル中のウイルス検出のための利用ポイント方法VirWaTest

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

核酸の濾過単離：簡易迅速DNA抽出方法

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

迅速・安全・簡易マニュアルベッドサイド核酸抽出の全血試料中のウイルス検出

要約

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この動画の章

エンテロウイルスと文化およびRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。パートIII。 RT-qPCRによりウイルス検出

ヌクレオカプシドからウイルスDNAの調製

共通液ハンドリングロボットでTruTipテクノロジーを使用して臨床検体からのDNAやRNAのハイスループット、自動抽出

ナノポアシーケンシングを用いた全血からの mRNA の配列決定

陰イオン交換樹脂を用いるバイオエアロゾルからのウイルスの検出

関連付けられているウイルスおよび細胞タンパク質の同定のウイルス DNA の精製

臨床サンプルからのRNAウイルスの公平なディープシーケンシング

新しいウイルスのゲノムを発見する感染葉からの RNA の解析とウイルス粒子粗抽出 DNA の結合解析

水サンプル中のウイルス検出のための利用ポイント方法VirWaTest

核酸の濾過単離：簡易迅速DNA抽出方法

迅速・安全・簡易マニュアル ベッドサイド核酸抽出の全血試料中のウイルス検出

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エンテロウイルスと文化およびRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。パートIII。 RT-qPCRによりウイルス検出

ヌクレオカプシドからウイルスDNAの調製

共通液ハンドリングロボットでTruTipテクノロジーを使用して臨床検体からのDNAやRNAのハイスループット、自動抽出

ナノポアシーケンシングを用いた全血からの mRNA の配列決定

陰イオン交換樹脂を用いるバイオエアロゾルからのウイルスの検出

関連付けられているウイルスおよび細胞タンパク質の同定のウイルス DNA の精製

臨床サンプルからのRNAウイルスの公平なディープシーケンシング

新しいウイルスのゲノムを発見する感染葉からの RNA の解析とウイルス粒子粗抽出 DNA の結合解析

水サンプル中のウイルス検出のための利用ポイント方法VirWaTest

核酸の濾過単離：簡易迅速DNA抽出方法

迅速・安全・簡易マニュアルベッドサイド核酸抽出の全血試料中のウイルス検出