Name: rapid, safe, and simple manual bedside nucleic acid extraction for the detection of virus in whole blood samples
Uploaded: 2018-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
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Wir danken Susanne Lopes Rasmussen und Solvej Kolbjørn Jensen für ihre technische Unterstützung und für den Umgang mit der klinischen Proben. Dieses Projekt ist Teil des Konsortiums EbolaMoDRAD, die Mittel aus der innovativen Medizin Initiative 2 gemeinsamen Unternehmens unter Grant Vereinbarung N ° 115843 erhalten hat. Dieses gemeinsame Unternehmen erhält Unterstützung von der Europäischen Union Horizont 2020 Forschungs- und Innovationsprogramm und EFPIA.

Der Ausschuss für biomedizinische Forschungsethik, Hauptstadtregion Einwilligung gegeben hat, und alle hier beschriebene Verfahren befreit aus einer Überprüfung durch die Ethik-Ausschuß-System gemäß dem dänischen Gesetz über Assay-Entwicklung-Projekte.
1. Vorbereitung des Vakuum Blutentnahmeröhrchen für Virus-Inaktivierung und schnellen NA-Extraktion
Achtung: Der Puffer verwendet für dieses Protokoll enthält Guanidinium-Thiocyanat (GITC) und nichtionischen Tensiden, die Reizstoffe sind. In geeigneten Laboratorien Schutzmaßnahmen ergreifen, verwenden eine Fluss-Haube und Handschuhe beim Umgang. Vermeiden Sie Haut- und Augenkontakt. Wenn der Puffer verschüttet ist, muss die zu reinigende Oberfläche nie direkt mit Chloramin oder Natriumhypochlorit (die Wirkstoffe in "Bleach") desinfiziert werden, da diese Mischung zu der Bildung von toxischen Zyanid führen kann. Erstens die verschüttete Puffer mit einem saugfähigen Tuch aufwischen. Anschließend reinigen Sie die Oberfläche mit 70 % Ethanol und dann mit Wasser und schließlich Chloramin oder Natriumhypochlorit.
<ol><li>Um das Vakuum Blutentnahmeröhrchen vorzubereiten, injizieren Sie 1,6 mL des Puffers bestimmten kommerziellen Lyse in einer Vakuumröhre 4 mL EDTA durch Punktion des Deckels des Röhrchens mit einer 25 x 1 Nadel und einer Spritze 3 mL. Hinweis: Nehmen Sie nicht den Deckel von der Vakuum-Röhre. Das Vakuum muss eingehalten werden.</li>
	<li>Die Vakuum-Röhren, enthält des Puffers bei Raumtemperatur bis zu seiner Verwendung zu speichern. Hinweis: Die Rohre sind für mindestens 1 Jahr nach ihrer Herstellung stabiler.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Puffer für die NA-Extraktion
<ol><li>Die Puffer für eine NA-Extraktion, Platz zwei 1,8 mL, zwei 4,5 mL und einem 3,6 mL Röhrchen in einem Rack vorzubereiten.</li>
	<li>Durch pipettieren, 960 µL des magnetischen Glaspartikeln (Map) eine saubere 1,8 mL Tube und Label mit Map. Aufschwemmen die MGP-Aufhängung komplett vor pipettieren sie hinzufügen. Hinweis: Die Map neigen dazu, schnell an der Unterseite des Rohres zu sammeln.</li>
	<li>Fügen Sie durch pipettieren, 4 mL Waschpuffer ich zu einem sauberen 4,5 mL Schlauch und beschriften Sie sie als WB-1. Achtung: Waschpuffer I enthält Guanidinium Chlorid, das reizend ist. In geeigneten Laboratorien Schutzmaßnahmen ergreifen, verwenden eine Fluss-Haube und Handschuhe beim Umgang. Vermeiden Sie Haut- und Augenkontakt.</li>
	<li>Hinzufügen von pipettieren, 1,5 mL Waschpuffer II zu einem sauberen 3,6 mL Schlauch und bezeichnen es als WB-2.</li>
	<li>Hinzufügen von pipettieren, 3 mL Waschpuffer III zu einem sauberen 4,5 mL Schlauch und bezeichnen es als WB-3.</li>
	<li>Fügen Sie durch pipettieren, 100 µL der Elution Puffer, um eine saubere 1,8 mL-Tube und beschriften Sie sie als EB.</li>
	<li>Die regelmäñig Puffer bei Raumtemperatur bis zu seiner Verwendung zu speichern. Hinweis: Die Rohre sind für mindestens 1 Monat nach ihrer Herstellung stabiler.</li>
</ol>3. Blutentnahme von Patienten mit Anzeichen und Symptome einer Virusinfektion
Achtung: Ergreifen Sie in geeigneten Laboratorien Schutzmaßnahmen, wenn Vollblut des Patienten zu sammeln. Tragen Sie Handschuhe und Brille. Wenn der Patient isoliert ist, folgen Sie bitte Biosafety Niveau 4 Verfahren.
<ol><li>Um intravenöse Vollblut des Patienten zu sammeln, verwenden Sie eine Butterfly-Nadel mit KK Verlängerungsschlauch und einer Blut Sammlung Vakuumröhre, Lyse/Bindung Puffer enthält. Den Arm des Patienten in eine nach unten gerichtete Position ausruhen und dem Sammelrohr niedriger als der Butterfly-Nadel zu positionieren. Schmetterling Nadel in die Vene des Patienten und die KK-Erweiterung der Blut-Sammlung-Vakuum-Röhre beimessen. Hinweis: Dies verhindert Rückfluss.</li>
	<li>Mischen Sie nach der Blutentnahme den Inhalt des Röhrchens durch Umklappen der Röhre 5 - 10 mal. Hinweis: Durch den restlichen Unterdruck in dem Blut Sammelrohr, 1,6 mL Lyse/Bindung Puffer enthält, wird das Volumen der Probe erfasst automatisch 1,6 mL sein.</li>
	<li>Desinfizieren Sie die Außenseite des Schlauches mit 70 % Ethanol.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Rohre für 20 min bei Raumtemperatur. Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten und die volle Blutentnahmeröhrchen können bei-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C und 37 ° C für mindestens 1 Monat7gelagert werden.</li>
	<li>Weiterhin die vereinfachte NA-Extraktions-Verfahren.</li>
</ol>4. vereinfachte NA Extraktion des Vollblutes
<ol><li>NA aus dem Lyse/Bindung Puffer-inaktivierten gesammelten Blut, Mischung zu reinigen Rohr den Inhalt des Röhrchens durch Umlegen des Vakuums von hand 5-10 X.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig den Deckel des Rohres und Entladen Sie den Deckel zu.</li>
	<li>Gießen Sie die vorbereiteten aliquoten Map (1 mL) direkt in das blutsammelröhrchen.</li>
	<li>Legen Sie einen neuen Deckel aus einer ungenutzten Blut Sammelrohr auf das Rohr mit der Probe.</li>
	<li>Legen Sie einen Finger auf den Deckel, um sicherzustellen, dass der Schlauch fest verschlossen ist und den Inhalt des Rohres durch Umklappen das blutsammelröhrchen 5-10 mal von hand mischen.</li>
	<li>Legen Sie das Rohr in den Magnet Holder und halten Sie einen Finger auf den Deckel, um sicherzustellen, dass der Schlauch fest verschlossen ist.</li>
	<li>Flip-Magnethalter mit dem Rohr ein paar Mal von Hand um sicherzustellen, dass die Map auf der Seite des Rohres mit dem Magneten gesammelt werden. Hinweis: Der Magnethalter kann mit einem länglichen Magneten und einem Gummiband ersetzt werden.</li>
	<li>Entfernen Sie den Deckel des Rohres und verwerfen Sie den Inhalt des Rohres mit einer Einweg-Pipette oder einfach durch Gießen den Inhalt in ein Sammelrohr 50 mL. Hinweis: Vermeiden Sie Aerosole aus dem Sammelrohr 50 mL durch das Rohr mit einem Deckel schließen.</li>
	<li>Gießen Sie die vorbereiteten aliquoten von WB-1 (4 mL) direkt in das blutsammelröhrchen.</li>
	<li>Setzen Sie den Deckel auf die Tube und legen Sie einen Finger auf den Deckel, um sicherzustellen, dass der Schlauch fest verschlossen ist.</li>
	<li>Entfernen Sie das Rohr aus der Magnethalter, dabei den Deckel fest angezogen mit einem Finger. Hinweis: Wenn ein Magnet und ein Gummiband verwenden, entfernen Sie einfach das Gummiband und Magnet aus der Tube.</li>
	<li>Die Map durch Umklappen das blutsammelröhrchen eigenhändig 5-10mal aufzuwirbeln.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.6-4.8.</li>
	<li>Gießen Sie die vorbereiteten aliquoten WB-2 (1,5 mL) direkt in das blutsammelröhrchen.</li>
	<li>Setzen Sie den Deckel auf das Rohr und entfernen Sie das Rohr aus der magnetischen Halterung zu. Hinweis: Wenn ein Magnet und ein Gummiband verwenden, entfernen Sie einfach das Gummiband und Magnet aus der Tube.</li>
	<li>Legen Sie einen Finger auf den Deckel, um sicherzustellen, dass der Schlauch fest verschlossen ist.</li>
	<li>Aufschwemmen der Map durch Umklappen das blutsammelröhrchen für ein paar Sekunden von hand.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 4.6-4.8.</li>
	<li>Gießen Sie die vorbereiteten aliquoten von WB-3 (3 mL) direkt in das blutsammelröhrchen.</li>
	<li>Setzen Sie den Deckel auf das Rohr und entfernen Sie das Rohr aus der magnetischen Halterung zu. Hinweis: Wenn ein Magnet und ein Gummiband verwenden, entfernen Sie einfach das Gummiband und Magnet aus der Tube.</li>
	<li>Legen Sie einen Finger auf den Deckel, um sicherzustellen, dass der Schlauch fest verschlossen ist.</li>
	<li>Die Map durch Umklappen das blutsammelröhrchen eigenhändig 5-10mal aufzuwirbeln.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.6-4.8.</li>
	<li>Gießen Sie die vorbereiteten aliquoten EB (100 µL) direkt in das blutsammelröhrchen.</li>
	<li>Setzen Sie den Deckel auf das Rohr und entfernen Sie das Rohr aus der magnetischen Halterung zu. Hinweis: Wenn ein Magnet und ein Gummiband verwenden, entfernen Sie einfach das Gummiband und Magnet aus der Tube.</li>
	<li>Aufschwemmen der Map in der EB durch das blutsammelröhrchen 5-10 mal mit dem Finger antippen. Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten, und die Rohre können bei-20 ° c gelagert werden</li>
	<li>Übertragen Sie einen Tropfen (5-8 µL) der resuspendierte Map in den nachgelagerten NA Verstärkung Reaktion Mix mit einer Einweg-1,5 mL-Pipette (keine nachgeschalteten diagnostische NA Verstärkung assay wie RT-Lampe oder qPCR/RT-qPCR-Assays verwendet werden können). Hinweis: Das NAs wird halten Sie sich an die Map, so sicher sein, verwenden Sie die Map in der nachgelagerten NA Verstärkung Reaktion. Mischen Sie die MGP Suspension vor dem Gebrauch. Nach dem Mischen werden die Map an der Unterseite des Rohres sammeln.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+Highly+Sensitive+Molecular+Diagnosis+of+Zika+Virus+by+Lateral+Flow+Assays.">Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays.</a> Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).</li><li>Benzine, J. W., Brown, K. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Bericht beschreiben wir eine sichere, schnelle und einfache manuelle am Krankenbett NA Extraktionsmethode für die nachgelagerten molekulare Erkennung eines Virus im Vollblut Lyse/Bindung Puffer inaktiviert. Die beschriebenen NA-Extraktions-Verfahren wurde entwickelt, um direkt auf Vollblut-Proben im Vakuum Blutentnahmeröhrchen, enthält die Lyse/Bindung Puffer (Table of Materials)7durchgeführt werden. Dieser spezielle Puffer inaktiviert EBOV7 u...

In Virus Ausbruch Situationen wenn Patienten auf das Krankenhaus Isolierstationen oder wenn eine schnelle Diagnose benötigt wird beschränkt sind, ist eine sichere, einfache und genaue Molekulare Diagnostik der Point-of-Care unerlässlich, dass die Patienten Pflege und Risiko Containment. Die zwei jüngsten virale Ausbrüche, das Ebola-Virus (EBOV) in Westafrika (2013) und der Zika-Virus in Südamerika (2015), haben das Interesse an verbesserte Point-of-Care Molekulare diagnostische Tests, wie z. B. reverse Transkription Schleife-vermittelten Isothermen erhöht. Verstärkung (RT-Lampe)1,2 und Rekombinase Polymerase Verstärkung (RPA)3,4. RT-Lampe und RPA sind schnelle, sensitive und spezifische Molekulare Tests, die auf vereinfachtes Beispiel Vorbereitungen durchgeführt werden können. Für das Zika-Virus wurde RT-Lampe mit einem lateralflow-Assay (LFA), kombiniert die Zika-Virus in Vollblut-gereinigte Proben innerhalb von 30 min1erkennen kann; für EBOV, das ist ein Risiko-Gruppe 4-Pathogen eingestuft und ist hoch ansteckend, die Proben müssen jedoch unter Biosafety behandelt werden Stufe 4 (BSL-4) Bedingungen und inaktiviert werden, bevor eine sichere diagnostischen Verfahren durchgeführt werden können.
Vereinfachte Inaktivierungsverfahren für EBOV, wie die Zugabe von Lyse Puffer auf die Probe2,3,4,5, dienten während des Ausbruchs; Diese Methoden erfordern jedoch Handhabung BSL-4 Bedingungen mit Laborgeräten, wie BSL-3 Biosafety Schränke, Zentrifugen, Heizblöcke und Pipetten, auf ein Minimum. Dieses Gerät ist normalerweise nicht vorhanden, Isolierstationen oder in Feldlazaretten. Um diese Herausforderung zu meistern, wurden Versuche unternommen, im Koffer3Diagnostik durchzuführen, und mehrere tragbare Geräte und Maschinen wurden entwickelt [z. B.ein tragbares Gerät zur Gewinnung von Nukleinsäure (NA)]6. EBOV-positiven Proben müssen jedoch noch inaktiviert werden, bevor diese Geräte verwendet werden können.
Wir haben zuvor eine schnelle am Krankenbett Virus-Inaktivierung-Methode zur EBOV7, Vaccinia Virus und Kuhpocken-Virus8 durch Zugabe eines kommerziellen Lyse/Bindung-Puffers zu gewöhnlichen Vakuum Blutentnahmeröhrchen, berichtet ermöglicht den direkten Übertragung von Blut aus dem Patienten in die Inaktivierung Puffer7. Diese direkte und sofortige Inaktivierung in einem geschlossenen System eliminiert die Notwendigkeit für die Proben unter Verwendung strikte Einschließung, z. B. BSL-4 Bedingungen7, Handhabung und die Proben können unter Normalbedingungen BSL-2 behandelt werden. Diese Inaktivierung Methode ist kompatibel mit mehreren NA Absauganlagen, wie Roboter und Hand-Reinigung-Kits-7; Diese Methoden erfordern jedoch Laborgeräte wie Roboter, Zentrifugen und Elektrizität, die nicht immer in den Bereich Einstellungen oder im Krankenhaus Isolierstationen vorhanden sind.
In diesem Bericht beschreiben wir eine sichere, schnelle und vereinfachte manuelle NA Extraktionsmethode für die anschließende molekulare Erkennung eines Virus im Vollblut Lyse/Bindung Puffer inaktiviert. Die NA-Extraktions-Verfahren erfordert keine Geräte außer einem Magnet/Magnethalter. Für die NA-Extraktion werden keine Zentrifugen, Heizung, Blöcke oder Strom benötigt. Daher, diese Methode ist nicht abhängig von Laboreinrichtungen und lässt sich problemlos überall (z.B.in Feldlazaretten in Isolation Krankenstationen oder mit geringen Ressourcen Einstellungen) verwendet. Die NA-Extraktions-Verfahren ist schnell und einfach und kann direkt in alle nachgelagerten NA-Tests wie qPCR, RT-qPCR, Lampe oder RT-Lampe verwendet werden. Wenn diese NA-Extraktions-Verfahren mit Lampe und ein tragbares batteriebetriebenes Isothermen Instrument kombiniert wird, erhalten Sie eine Nachttisch Diagnose innerhalb von 40 Minuten die Blutentnahme.

<table><tbody><tr><td>Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL)</td><td>Becton Dickinson</td><td>368861</td><td></td></tr><tr><td>Plus Blood Collection</td><td>Becton Dickinson</td><td>362725</td><td></td></tr><tr><td>23G x 1 needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>LUER LOK syringe (3 mL)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309658</td><td></td></tr><tr><td>Butterfly needle with small-bore extension tubing</td><td>J&amp;oslash;rgen Kruuse A/S</td><td>121714</td><td></td></tr><tr><td>1% Virkon</td><td>Nomeco A/S</td><td>849265</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill</td><td>Roche Diagnostics A/S</td><td>03246752001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit</td><td>Roche Diagnostics A/S</td><td>3038505001</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&amp;trade; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>375418</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&amp;trade; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>379189</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&amp;trade; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>379146</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag&amp;trade;-5 Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12303D</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette (3.5 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.010</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;trade; Samco&amp;trade; Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>231</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;trade; Nunc&amp;trade; 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid, safe, and simple manual bedside nucleic acid extraction for the detection of virus in whole blood samples

Die schnelle Diagnose einer Infektion ist entscheidend für den Ausbruch Management, Risiko Containment und Patientenversorgung. Wir haben zuvor eine Methode für die schnelle am Krankenbett Inaktivierung des Ebola-Virus während der Blutentnahme für sichere Nukleinsäure (NA) Tests gezeigt, indem man einen kommerziellen Lyse/Bindung Puffer direkt in das Vakuum Blutentnahmeröhrchen. Mit diesem Ansatz am Krankenbett Inaktivierung, entwickelten wir eine sichere, schnelle und vereinfachte am Krankenbett NA Extraktionsmethode für die spätere Entdeckung eines Virus im Vollblut Lyse/Bindung Puffer inaktiviert. Die NA-Extraktion erfolgt direkt in die Blutentnahmeröhrchen und erfordert keine Ausrüstung oder Strom.
Nachdem das Blut in den Lyse/Bindung Puffer gesammelt, die Inhalte werden durch Umklappen das Rohr von hand gemischt und die Mischung wird für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Magnetische Glaspartikeln (Map) werden hinzugefügt, um das Rohr, und der Inhalt sind durch Umklappen das sammelröhrchen von hand gemischt. Die Map werden dann auf der Seite das blutsammelröhrchen mit einem Magnethalter oder ein Magnet und ein Gummiband gesammelt. Die Map werden dreimal gewaschen, und nach der Zugabe der Elution Puffer direkt in das sammelröhrchen, die NAs sind bereit für NA-Tests, wie qPCR oder Isothermen Schleife Verstärkung (Lampe), ohne die Entfernung von der Map aus der Reaktion. Die NA-Extraktions-Verfahren ist nicht abhängig von jedem Laboreinrichtungen und lässt sich problemlos überall (z.B.in Feldlazaretten und Krankenhaus Isolierstationen) verwendet. Wenn diese NA-Extraktions-Verfahren mit Lampe und ein tragbares Gerät kombiniert wird, erhalten Sie eine Diagnose innerhalb von 40 Minuten die Blutentnahme.

Die hier vorgestellten Protokoll ist einfach und effizient und kann auch im großen und ganzen auf eine molekulare Assay auf infektiöse Vollblut Proben mit dem Puffer Lyse/Bindung inaktiviert durchgeführt werden. Der Workflow für die Inaktivierung von Blut und NA-Extraktion ist in Abbildung 1, einschließlich der Vorbereitung von Blut Sammlung Vakuumröhren7 (Abbildung 1A), die Blut Sammlung<sup class="...

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Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die schnelle Virus Nukleinsäure-Extraktion aus der Vollblut-Virus inaktiviert. Die Extraktion erfolgt direkt in die Blutentnahmeröhrchen und erfordert keine Ausrüstung oder Strom. Die Methode ist nicht abhängig von Laboreinrichtungen und kann überall (z.B.in Feldlazaretten) verwendet.

Schnelle, sichere und einfache manuelle am Krankenbett Nukleinsäure-Extraktion für den Nachweis des Virus in Vollblut-Proben

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

rapid-safe-simple-manual-bedside-nucleic-acid-extraction-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.3K Aufrufe.  Statens Serum Institut. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die schnelle Virus Nukleinsäure-Extraktion aus der Vollblut-Virus inaktiviert. Die Extraktion erfolgt direkt in die Blutentnahmeröhrchen und erfordert keine Ausrüstung oder Strom. Die Methode ist nicht abhängig von Laboreinrichtungen und kann überall (z.B.in Feldlazaretten) verwendet.

Serie: Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

EPA-Methode 1615 Messung der Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser, Kultur und RT-qPCR. Teil III. Virenerkennung durch RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Forschung

Umwelt

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

Herstellung viraler DNA aus Nukleokapside

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Immunologie und Infektion

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. The geometry of the monolith can be adapted for specific pipette tips ranging in volume from 1.0 to 5.0 ml. The large porosity of the monolith enables viscous or complex samples to readily pass through it with minimal fluidic backpressure. Bi-directional flow maximizes residence time between the monolith and sample, and enables large sample volumes to be processed within a single TruTip. The fundamental steps, irrespective of sample volume or TruTip geometry, include cell lysis, nucleic acid binding to the inner pores of the TruTip monolith, washing away unbound sample components and lysis buffers, and eluting purified and concentrated nucleic acids into an appropriate buffer. The attributes and adaptability of TruTip are demonstrated in three automated clinical sample processing protocols using an Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR and STARplus liquid handling robots, including RNA isolation from nasopharyngeal aspirate, genomic DNA isolation from whole blood, and fetal DNA extraction and enrichment from large volumes of maternal plasma (respectively).

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. Consequently, the sample preparation format is compatible with most liquid handling instruments, and can be used for many medium to high-throughput clinical applications and sample types.

Hochdurchsatz-, Automated Extraktion von DNA und RNA aus klinischen Proben mit TruTip Technologie Gemeinsames Liquid Handling Robots

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Biotechnik

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

Sequenzierung von mRNA aus Vollblut mit Nanopore-Sequenzierung

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Genetik

Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid impingement-based air sampling devices for efficacious concentration of negatively-charged viruses from bioaerosols. Thus, the resin serves as an additional concentration step in the bioaerosol sampling workflow. Nucleic acid extraction of the viral particles is then performed directly from the anion exchange resin, with the resulting sample suitable for molecular analyses. Further, this protocol describes a custom-built bioaerosol chamber capable of generating virus-laden bioaerosols under a variety of environmental conditions and allowing for continuous monitoring of environmental variables such as temperature, humidity, wind speed, and aerosol mass concentration. The main advantage of using this protocol is increased sensitivity of viral detection, as assessed via direct comparison to an unmodified conventional liquid impinger. Other advantages include the potential to concentrate diverse negatively-charged viruses, the low cost of anion exchange resin (~$0.14 per sample), and ease of use. Disadvantages include the inability of this protocol to assess infectivity of resin-adsorbed viral particles, and potentially the need for the optimization of the liquid sampling buffer used within the impinger.

An anion exchange resin-based method, adapted to liquid impingement-based bioaerosol sampling of viruses is demonstrated. When coupled with downstream molecular detection, the method allows for facile and sensitive detection of viruses from bioaerosols.

Erkennung von Viren von Bioaerosolen Anion Austausch Harz

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

Reinigung der viralen DNA für die Identifizierung von assoziierten viralen und zellulären Proteinen

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from clinical and biological sources. The method is unbiased and universal; it uses random primers for cDNA synthesis and requires no prior knowledge of the viral sequence content. Before library construction, selective RNase H-based digestion is used to deplete unwanted RNA &#8212; including poly(rA) carrier and ribosomal RNA &#8212; from the viral RNA sample. Selective depletion improves both the data quality and the number of unique reads in viral RNA sequencing libraries. Moreover, a transposase-based &#39;tagmentation&#39; step is used in the protocol as it reduces overall library construction time. The protocol has enabled rapid deep sequencing of over 600 Lassa and Ebola virus samples-including collections from both blood and tissue isolates-and is broadly applicable to other microbial genomics studies.

This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

Unvoreingenommene Tiefe Sequenzierung von RNA-Viren aus klinischen Proben

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

Medizin

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low titers in their host or cannot be mechanically inoculated to another host are difficult to propagate to achieve a greater titer of infectious material. Infected leaves are ground in a mild buffer with optimal pH and ionic composition recommended for purifying most bacilliform Para retroviruses. Urea is used to break up inclusion bodies that trap virions and to dissolve cellular components. Differential centrifugation provides further separation of virions from plant contaminants. Then proteinase K treatment removes the capsids. Then the viral DNA is concentrated and used for next-generation sequencing (NGS). The NGS data are used to assemble contigs which are submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in the generated dataset. In a parallel pipeline, RNA is isolated from infected leaves using a standard column-based RNA extraction method. Then ribosome depletion is carried out to enrich for a subset of mRNA and virus transcripts. Assembled sequences derived from RNA sequencing (RNA-seq) were submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in this dataset. In our study, we identified two related full-length badnavirus genomes in the two datasets. This method is preferred to another common approach which extracts the aggregate population of small RNA sequences to reconstitute plant virus genomic sequences. This latter metagenomic pipeline recovers virus related sequences that are retro-transcribing elements inserted into the plant genome. This is coupled to biochemical or molecular assays to further discern the actively infectious agents. The approach documented in this study, recovers sequences representative of replicating viruses that likely indicate active virus infection.

Here we present a new approach to identify plant viruses with double-strand DNA genomes. We use standard methods to extract DNA and RNA from infected leaves and carry out next-generation sequencing. Bioinformatic tools assemble sequences into contigs, identify contigs representing virus genomes and assign genomes to taxonomic groups.

Kombination von Analyse von DNA in eine grobe Virion-Extraktion mit der Analyse der RNA aus den infizierten Blättern, entdecken neue Virus-Genom

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food irrigation, washing, etc. The classical fecal bacteria indicator does not always check for the presence of viral pathogens so the detection of viral pathogens and viral indicators is relevant in order to adopt measures of risk mitigation, especially in humanitarian scenarios and in areas where water-borne viral outbreaks are frequent.
At present, several commercial tests allowing the quantification of fecal indicator bacteria (FIB) are available for testing at the point of use. However, such commercial tests are not available for the detection of viruses. The detection of viruses in environmental water samples requires concentrating several liters into smaller volumes. Moreover, once concentrated, the detection of viruses relies on methods such as nucleic acid extraction and molecular detection (e.g., polymerase chain reaction [PCR]-based assays) of the viral genomes.
The method described here allows the concentration of viruses from 10 L water samples, as well as the extraction of viral nucleic acids at the point of use, with simple and portable equipment. This allows the testing of water samples at the point of use for several viruses and is useful in humanitarian scenarios, as well as at any context where an equipped laboratory is not available. Alternatively, the method allows concentrating viruses present in water samples and the shipping of the concentrate to a laboratory at room temperature for further analysis.

Here we present VirWaTest, which is a simple, affordable and portable method for the concentration and detection of viruses from water samples at the point of use.

VirWaTest, eine Point-of-Use-Methode zum Nachweis von Viren in Wasserproben

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...