Biz Ella Weinert, Michelle Helms ve Marlis Badusche mükemmel teknik destek için analizleri Culex sivrisinekler, Jessica Börstler, Norbert Becker ve Björn Aedes albopictus yumurta ve Olli Vapalahti için sağlamak için Pluskota teşekkür ederim virüs hisse senedi sağlanması. ML Leibniz Derneği tarafından desteklenen; TESTERE-2014-SGN-3 verin.

1. dişi sivrisinekler hazırlayın
<ol><li>Sivrisinekler bir aspiratör (yaklaşık 400 sivrisinekler başına büyük kafes) kullanarak büyük bir kafes toplamak.</li>
	<li>Karbondioksit (CO2) 7 için sivrisinek anestezi s.</li>
	<li>Plastik şişe başına 20 kadın sıralamak (Ø 50 mm × 100 mm). Not: sivrisinekler uyan başka bir 3 kullanırsanız, s Co2.
</li>
	<li>Sivrisinekler gecede açlıktan.</li>
</ol>2. yapay kan yemek
Not: Tüm adımlar BSL-3 koşullar altında gerçekleştirilir.
<ol><li>
Bulaşıcı kan yemek hazırlayın.
	<ol>
<li>1 x 108 plak oluşturan birimler (PFU) konsantrasyonu virüs stok seyreltik / mL. Not: Hisse senedi toplama doku kültürü bulaşma dozu 50 yönteminin (TCID50) gerçekleştirerek belirlenir ve Spearman & Kärber algoritması10,11tarafından hesaplanır.</li>
		<li>Mix süresi insan kanı (kan koruma) kan bankasından (için uygun değildir artık, ama sivrisinekler için yararlı insan) Sığır serum (FBS) ve çalışma çözümü virüs stokunun ile fruktoz (%8 çözüm), filtrated (insan kan: fruktoz: FBS süresi: çalışma çözüm 5:3:1:1 =). Not: Bu bilinen doğal memeli ev sahibi ZIKV çünkü biz insan kanı, seçti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>140 µL kan yemek Mix TCID50 üzerinden daha fazla çözümleme için dondur.</li>
	<li>
Bu tür bağlı olarak farklı beslenme yöntemleri kullanarak yapay besleme gerçekleştirin:
	<ol>
<li>
Aedes aegypti: besleme sistemi 30 dk (Besleyici başına 1 mL) için bir membran kullanın.</li>
		<li>
Culex spp.: gecede bir pamuklu çubuk ile bulaşıcı kan sağlamak ve kan (şişe başına 300 µL) kadar sıcak değil.</li>
		<li>
Aedes albopictus: iki damlacıkları (50 µL her) kan yemek karışımı plastik şişe koymak ve 2s için yem sivrisinekler yapalım. Kanı sıcak değil. Not: Sivrisinek ilk 15 dk içinde besleyecek. Güvenlik nedeniyle nedeniyle uzun süreli kuluçka zamanı gereklidir. 2 h, böylece kirlenme riski sıralanması sırasında düşürülmüştür sivrisinekler beslenen sonra kan damlacıkları süzülmüş.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CO2 7 için sivrisinek anestezi s. Not: sivrisinekler uyan başka bir 3 kullanırsanız, s CO2.</li>
	<li>Tam olarak sıralama ve sayısı sivrisinekler yeni bir şişe tıkanmış.</li>
	<li>Fruktoz (%8 çözüm) şişe ve bir fiş arasında ile doymuş bir pamuk yastık ekleyin.</li>
	<li>Sivrisinek belirlenen sıcaklığı 18 ° C veya nem % 80 27 ° C 14 veya 21 gün boyunca tutun.</li>
	<li>Sivrisinek fruktoz doymuş Pamuklu ped ile beslenir. Her 72 h fruktoz flakon (%8 çözüm) 1,5 mL ile doldurmak (en fazla 20 sivrisinekler, bağlı olarak besleme oranı, adım 2.5 bakınız).</li>
</ol>3. zorla salya tahlil günde 14 ya da 21
Not: Tüm adımlar BSL-3 koşullar altında gerçekleştirilir.
<ol><li>2 x 104 Vero hücreleri tohum / 96 bir kuyu başı plaka (değiştirilmiş Dulbecco´s takıma %3 FBS, 100 U/mL penisilin, 100 mg/mL streptomisin, 5 µg/mL Amfoterisin B, 2 mM L-glutamin ile kartal Orta (DMEM) büyüme ortamının 200 µL ile iyi % 1 esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), % 1 Sodyum pyruvate).</li>
	<li>
Salya cihazını hazırlayın:
	<ol>
<li>Bir açı 30 ° bankta bir kare cam levha (20 × 20 cm) yerleştirin. Not: Bu underpressure Emanet laboratuarında nedeniyle gereklidir. Plaka yatay veya dikey ise, sıvı sızıntısı olacak.</li>
		<li>Çift taraflı yapışkan bant cam levha üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Rol modelleme kil bu kadar 0.5 cm çapında ulaşır ve yatay olarak 1 cm çift taraflı yapışkan bant uzakta ekleyebilirsiniz.</li>
		<li>10 µL filtre ucu ucuna ilk 0.3 cm kesti. Not: Bu dışında Biyogüvenlik Laboratuvar deney başlamadan önce hazırlamak için tavsiye edilir.</li>
		<li>Filtre ipuçları fosfat tamponlu tuz (PBS, pH 7,4) 10 µL ile doldurun.</li>
		<li>Filtre ipuçları modelleme kil yapışkan bant doğru ucu yerleştirin.</li>
		<li>Hafif basınç ile filtre ipuçları güvenli.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sivrisinekler hazırlayın:
	<ol>
<li>Sivrisinek CO2ile anestezi.</li>
		<li>Bacaklar ve kanatlar sivrisinekler hareketsiz kaldırın.</li>
		<li>Yaşayan sivrisinek yapışkan bant filtre bahşiş yukarıda cesetleri gidermek.</li>
		<li>Hortum yavaşça filtre ucu yerleştirin.</li>
		<li>Salya tahlil 30 dk için çalıştırın.</li>
		<li>Filtre ipuçları kaldırmak ve kil ve teyp atın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. tükürük işlenmesi
Not: Adımlar 4.1 – 4.6.2 BSL-3 koşullar altında gerçekleştirilir.
<ol><li>İçeriği içeren PBS 10 µL tepki tüpler içine sınırdışı.</li>
	<li>Karışımı yavaşça ve içeriği örnek başına bir şey kullanarak hazırlanmış 96 iyi plaka kuyu içine aktarın.</li>
	<li>Plaka 37 ° c % 5 CO2ile 7 gün kuluçkaya.</li>
	<li>Binoküler hücreler cytopathic etkisi (CPE) varlığı için kontrol etmek için kullanın.</li>
	<li>Kuyu için CPE pozitifse süpernatant, tarafından pipetting 140 µL RNA çıkarılması için bir tepki tüp içine hasat.</li>
	<li>
RNA, RNA ekstraksiyon kiti kullanarak arındırmak.
	<ol>
<li>Mix 140 µL süpernatant, 560 µL AVL ile (viral lizis arabellek) tampon ve oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.</li>
		<li>560 µL etanol (% 96) ve girdap örnek ekleyin. Not: Örnekleri bu adımdan sonra inaktive ve BSL-3 Laboratuvardan dışarı taburcu.</li>
		<li>Damlalıklı 630 µL üzerine bir sütun ve 1 dk. için 6.000 x g ile santrifüj örnek.</li>
		<li>Filtrate, damlalıklı sütun üzerinde kalan 630 µL atmak ve aralıklarla tekrarlayın.</li>
		<li>RNA yıka, sütun, membran, 6.000 x g 1 dk. için de arabelleğe 1 sütun ve santrifüj yıkama 500 µL ekleyerek bağlı.</li>
		<li>Toplama tüp atın ve sütun yeni bir koleksiyon tüp içine yerleştirin. 500 µL çamaşır tampon 2 ve santrifüj 12.500 x g 3 dk de ekleyin.</li>
		<li>Toplama tüp atın ve sütun bir 1,5 mL tepki tüp içine yerleştirin.</li>
		<li>50 µL elüsyon arabelleği ekleyin ve oda sıcaklığında 1 dk. için kuluçkaya.</li>
		<li>6.000 x g 1 dk. için de santrifüj kapasitesi ve sonra sütun atar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ZIKV RNA RT-qPCR üzerinden için örnekleri analiz.</li>
</ol>5. sivrisinek organları işlenmesi
Not: Adımlar 5.1-5,5 BSL-3 koşullar altında gerçekleştirilir.
<ol><li>Sivrisinek organlarının çıkarın ve her vücut tepki tüp içine yerleştirin. Not: Bu noktada deneme duraklatmak ve örnekleri-80 ° C'de depolamak mümkündür</li>
	<li>Homojenizasyon medya (DMEM herhangi bir supplementals olmadan) 500 µL tepki tüp içine ekleyin.</li>
	<li>El motor Mikser kullanarak vücudun homojenize ve her örnek için yeni bir pistil kullanın.</li>
	<li>Homogenate 200 µL 96 iyi plaka arıtma içine ekleyin. Not: Bu noktada deneme duraklatmak ve örnekleri-80 ° C'de depolamak mümkündür</li>
	<li>60 ° C'de 60 dk için kuluçka tarafından plaka devre dışı bırakma</li>
	<li>RNA tarafından otomatik nükleik asit arıtma arındırmak. Not: Bu noktada deneme duraklatmak ve örnekleri-80 ° C'de depolamak mümkündür</li>
</ol>6. analiz
<ol><li>Viral RNA kopyaları RT-qPCR kullanarak ölçmek. Not: RNA kopya tüm ZIKV pozitif sivrisinek organları üzerinde ve ZIKV negatif sivrisinek dahil olmadan ortalama.</li>
	<li>ZIKV-pozitif sivrisinek ceset sayısına göre beslenen kadın sayısı olarak tanımlanan IR, hesaplayın.</li>
	<li>Sivrisinek ZIKV pozitif tükürük sayısına göre ZIKV-pozitif sivrisinek organları ile sayısı olarak tanımlanan TR, hesaplayın. İletim hızı hiçbir ZIKV pozitif organları ile türler-sıcaklık birleşimler için hesaplanamadı.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Musso, D., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus.">Zika Virus.</a> Clinical Microbiology Reviews. (3), 487-524 (2016).</li><li>Epelboin, Y., Talaga, S., Epelboin, L., Dusfour, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+An+updated+review+of+competent+or+naturally+infected+mosquitoes.">Zika virus: An updated review of competent or naturally infected mosquitoes.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (11), e0005933 (2017).</li><li>Aliota, M. T., Peinado, S. A., Osorio, J. E., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culex+pipiens+and+Aedes+triseriatus+Mosquito+Susceptibility+to+Zika+Virus.">Culex pipiens and Aedes triseriatus Mosquito Susceptibility to Zika Virus.</a> Emerging Infectious Diseases. (10), 1857-1859 (2016).</li><li>Turell, M. J., Linthicum, K. J., Patrican, L. A., Davies, F. G., Kairo, A., Bailey, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+of+selected+African+mosquito+(Diptera:+Culicidae)+species+for+Rift+Valley+fever+virus.">Vector competence of selected African mosquito (Diptera: Culicidae) species for Rift Valley fever virus.</a> Journal of Medical Entomology. 45 (1), 102-108 (2008).</li><li>Cornel, A. J., Jupp, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+methods+for+determining+transmission+rates+in+vector+competence+studies+with+Culex+univittatus+and+West+Nile+and+Sindbis+viruses.">Comparison of three methods for determining transmission rates in vector competence studies with Culex univittatus and West Nile and Sindbis viruses.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 5 (1), 70-72 (1989).</li><li>Hurlbut, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+salivation+and+virus+transmission.">Mosquito salivation and virus transmission.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15 (6), 989-993 (1966).</li><li>Anderson, S. L., Richards, S. L., Smartt, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+determining+arbovirus+transmission+in+mosquitoes.">A simple method for determining arbovirus transmission in mosquitoes.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 26 (1), 108-111 (2010).</li><li>Heitmann, A., Jansen, S., L&#252;hken, R., Leggewie, M., Badusche, M., Pluskota, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+transmission+of+Zika+virus+by+mosquitoes+from+central+Europe.">Experimental transmission of Zika virus by mosquitoes from central Europe.</a> Eurovsurveillance. 22 (2), (2017).</li><li>Hierholzer, J. C., Killington, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Virus Isolation and Quantitation - Virology methods manual. , (1996).</li><li>Horzinek, R. W., Marian, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kompendium+der+allgemeinen+Virologie.">Kompendium der allgemeinen Virologie.</a> Zentralblatt f&#252;r Veterin&#228;rmedizin R A. 32 (1-10), 480 (2010).</li><li>Richard, V., Paoaafaite, T., Cao-Lormeau, V. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+French+Polynesian+Aedes+aegypti+and+Aedes+polynesiensis+for+Zika+Virus.">Vector Competence of French Polynesian Aedes aegypti and Aedes polynesiensis for Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), (2016).</li><li>Fortuna, C., Remoli, M. E., Di Luca, M., Severini, F., Toma, L., Benedetti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+studies+on+comparison+of+the+vector+competence+of+four+Italian+Culex+pipiens+populations+for+West+Nile+virus.">Experimental studies on comparison of the vector competence of four Italian Culex pipiens populations for West Nile virus.</a> Parasites &amp; Vectors. 8, 463 (2015).</li><li>Weger-Lucarelli, J., R&#252;ckert, C., Chotiwan, N., Nguyen, C., Garcia Luna, S. M., Turell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+American+Mosquitoes+for+Three+Strains+of+Zika+Virus.">Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), (2016).</li><li>Dubrulle, M., Mousson, L., Moutailler, S., Vazeille, M., Failloux, A. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus+and+Aedes+mosquitoes:+saliva+is+infectious+as+soon+as+two+days+after+oral+infection.">Chikungunya virus and Aedes mosquitoes: saliva is infectious as soon as two days after oral infection.</a> PLOS ONE. 4 (6), e5895 (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Daha önce zorla salya ile elde edilen sonuçların klasik yeniden beslenme deneyler6ile uyumlu olduğunu gösterilmiştir. Ancak, deneyler yeniden beslenme hem de zorla salya sunulan bizim Yöntem, doğrudan salya aktivite kanıt veya tükürük yayın izlemek imkansız. Diğer bileşenler tükürük sunmak için salya etkinliğini kanıtlamak için örnekleri test olabilir (Örn., proteinler, karbonhidratlar, vs.). Ayrıca, ek qPCRs viral RNA kopyaları algılama sağlayacak. Ancak, bu, duyarlılık durumunda çok düşük parçacık sayılar hücre kültür tahlil sınırlayabilir çeşitli analizler için tükürük örnekleri bölme gerektirir. Buna karşılık, bu kararlı iletim hızları bir küçümseme için neden olabilir.
Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için tüm sivrisinekler deneme sonuna kadar hayatta kalmak emin olmak gereklidir. Bu görsel olarak sivrisinek vücut hareket etkinliğini izlemeye tarafından denetlenir. Ayrıca, bu belirli sivrisinek türlerin iletilmesi için bilinen kontrol virüs besleme tarafından test edilecek salya tahlil ilke kullanımı verilen sivrisinek türler vardır. Tersi, bir deney tanıttı her virüs duyarlı bir sivrisinek test edilmesi gerekiyor.
Zorla salya deneyleri pek çok avantajı var. Sivrisinekler sayısının fazlalığı aynı anda tek bir örnek kontrollü standart koşullar altında temel üzerinde hayvan refahı düzenlemeleri9ile çakışmadan test edilebilir.
Yöntemi birkaç laboratuvarları tarafından kullanılır. Ancak, tam kurulumları, hangi sonuçları farklılıkları laboratuvarlar arasında yol açabilir farklı olabilir. Cam14 veya plastik15yapılmış tükürük toplamak için kılcal bir kritik bileşenidir. Biyogüvenlik seviye 3 insectary yüksek güvenlik düzenlemeleriyle uyum sağlamak için biz plastik filtre ipuçları yerine cam kılcal, böylece yaralanma riskini azaltarak kullanılır. Ayrıca, filtre ipuçları toplanan sıvı kolayca bir pipet kullanarak transfer edilebilir avantajı var.
Burada sunulan zorla salya tahlil Kur üzerinde birlikte çalışma ve görev paylaşımı iki müfettişler dayanmaktadır. Diğer aynı anda zorla salya Kur hazırlanırken sivrisinek demobilizing bir kişi tarafından gerçekleştirilir. Bu önemli ölçüde işlem süresi azaltır ve riski en aza indirir örnek olarak değişen terhis İşyeri ve salya-plaka arasında geçiş gerekli değildir. Ayrıca, bu sivrisinekler zorla salya aygıtta hemen sonra terhis yerleştirerek sağlar. İşlem süresi oldukça kısa bu sivrisinek için başarılı Zorlanmış salya esastır. Son olarak, sivrisinekler doğrudan bütün deneyin boyunca hareketliliği için takip edilebilir.
Burada sunulan salya tahlil sivrisinek tür vektör potansiyelini anlayışlar kazanmak için kullanılmaktadır. Ancak, bazı belirli diğer soruları cevaplamak için (Örneğin., omurgalıların bulaştırmak için gerekli olan sivrisinek ısırıkları numaralarını), hayvan deneyleri hala gerekli olabilir.

2015 yılında, Zika virüs (ZIKV), Flaviviridae, Columbia ve Brezilya ortaya çıktı ve bir salgın ile dikkate değer sayıda neden Amerika ve Karayipler, arasında hızla yayıldı ailesine ait olan sivrisinek yoluyla bulaşan bir virüs (mobovirus) ilişkili klinik durumlarda microcephaly ve Guillain-Barré sendromu1. Sivrisinekler Aedes aegypti ve Aedes albopictus türlerin birincil ve ikincil vektörel çizimler ZIKV2kabul edilir ama Aedes diğer türü de deneysel vektör yeterlilik3 var kanıtlanmıştır . Aedes tür aksine şimdiye kadar test Culex türlerin çoğu virüs4iletimi mümkün değildir. Sadece, Culex quinquefasciatus için verileri kesin sonuçları3sağlanan. Şu anda, bilgileri sivrisinek vektör yetkinlik üzerinde ZIKV için orta sıcaklık koşullarında bulunmamaktadır (< 20 ° C). Ancak, bu bilgiler Orta Avrupa gibi ılıman iklime sahip bölgelerde mümkün yayılır risk değerlendirmesi için önemli olur.
ZIKV için yetkili bir vektör elde etmek, korumak, yükseltmek ve son olarak virüs iletimi yapabiliyor. Bu nedenle, sivrisinek organları veya ceset parçalarını test, bacaklar, midgut, ya da tükürük bezleri, ZIKV için de dahil olmak üzere vektör yetkinlik belirlemek yeterli değildir. Bulaşıcı virüs parçacıkları yayımlanan tükürük içinde sınamak için zorunludur. Vektör yetki değerlendirmek için enfeksiyon oranını (IR, ZIKV pozitif sivrisinek ceset sayısına göre tıkanmış sivrisinekler sayısı) ve iletim hızı (TR, sivrisinek ZIKV pozitif tükürük sayısına göre ZIKV-pozitif sivrisinek organları ile sayısı), olmak zorunda belirledi. IRS sivrisinek kolayca ters transkriptaz gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) tarafından takip sadece homojenizasyon sivrisinekler tarafından analiz ZIKV hedefleme. Ayrıca, enfeksiyon daha fazla sivrisinek başına viral kopya numaraları belirlenerek karakterize edilebilir. Buna ek olarak, iletim hızları Analizi uygun virüs parçacıkları bireysel sivrisinekler tükürük içinde tespiti kullanır. Bu virüslü sivrisinek viremi5ana bilgisayar analizini ardından duyarlı ana bilgisayar hayvanlar üzerinde besleme tarafından sağlanabilir. Ancak, bu yöntem uygun model organizmalar üzerinde dayanır ve pahalı ve hayvan refahı düzenlemeleri tarafından kısıtlanmış. İletim hızları analiz etmek için Laboratuvar hayvanlarının kullanımını önlemek ve maliyetleri azaltmak için yapay besleme sistemleri yeniden kan damlacıkları olmuştur kullanarak6açıklanır. Ancak, bireysel ölçekte yüksek sayisi ile kombine test zor ve zaman alıcı. Son yıllarda zorla salya deneyler sivrisinekler3,8 vektör yetki değerlendirmek için seçtiğiniz yöntemi haline gelmiştir ve bireysel ölçekte bir salya testin ilk açıklama 19667 ' de yayınlanan .
Temel, Orta Avrupa bizim vektör yetkinlik çalışma sivrisinekler son zamanlarda9yayınladı, Anderson ve arktarafından belirlendiği şekilde zorla salya tarif. 8 bazı değişikliklerle. Bu yöntem, standart yüksek işlem hacmi yüksek Biyogüvenlik düzeyi koşullarda (BSL-3) deneysel ve aktif virüs tanımlaması hücre tabanlı kültürü deneyleri tarafından içerir sağlar. Burada açıklanan deneyler 856 sivrisinekler içerir. Onlar yapay kan yemek tarafından ZIKV ile enfekte olduğunu ve daha sonra tükürük bulaşıcı virüs parçacıkları varlığı için analiz. Culex oluşan deneyler iki köklü laboratuvar nüfus alanının yanı sıra Ae. aegypti ve Culex pipiens pipiens biotype molestus (Cx. s. molestus) tanıttı sivrisinekler yakaladı pipiens pipiens biotype pipiens (Cx. s. pipiens), Culex torrentium (Cx. torrentium) ve iki Ae. albopictus nüfus. İtalya'da toplanmıştır, iki Ae. albopictus nüfus, biri dışında tüm sivrisinekler Almanya'da toplanmıştır.

<table><tbody><tr><td>Inject+matic Sleeper</td><td>Inject+matic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bugdorm-1 Insect Rearing Cage</td><td>BugDorm Store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila cultivation tubes</td><td>carl roth</td><td>PK11.2</td><td>plastic vial for mosquitoes</td></tr><tr><td>Plug for drosophila cultivation tubes</td><td>carl roth</td><td>PK15.1</td><td></td></tr><tr><td>Constant climate chamber</td><td>Binder</td><td>KBF-240</td><td></td></tr><tr><td>Blood</td><td></td><td></td><td>banked human blood, expired, not usable for medical application</td></tr><tr><td>Dumont-Pincette Electronic SS</td><td>Dumont</td><td>B40c</td><td></td></tr><tr><td>Vero cells</td><td>BNITM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flash light aspirator</td><td>Bioquip</td><td>2809</td><td></td></tr><tr><td>double-sided adhesive tape</td><td></td><td></td><td>no specific provider</td></tr><tr><td>Gammex Powder-free gloves with AMT</td><td>Ansell</td><td></td><td>for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory</td></tr><tr><td>RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit</td><td>altona diagnostics</td><td>591013</td><td></td></tr><tr><td>MagMax Pathogen RNA/DNA Kit</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>4462359</td><td>RNA isolation of mosquito bodies</td></tr><tr><td>Qiamp viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td>RNA-Isolation of supernatant</td></tr><tr><td>filter tips (20 &amp;micro;L)</td><td>Sarstedt</td><td>701,116,210</td><td>Cut the first 3 mm of the tip</td></tr><tr><td>hand motor mixer</td><td>carl roth</td><td>sold out</td><td></td></tr><tr><td>micro pestles for hand motor mixer</td><td>carl roth</td><td>CXH8.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>P0403550</td><td></td></tr><tr><td>L Glutamine Penicilin/Streptomycin</td><td>PAN</td><td>P0819100</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>PAN</td><td>P06-0110</td><td></td></tr><tr><td>Fructose</td><td>carl roth</td><td>4981.5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>PAN</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvat</td><td>PAN</td><td>P0443100</td><td></td></tr><tr><td>MEM NAA</td><td>PAN</td><td>P0832100</td><td></td></tr><tr><td>Hemotek Feeder</td><td>Hemotek</td><td>PS6</td><td></td></tr><tr><td>Light Cycler</td><td>Roche</td><td>480 II</td><td></td></tr><tr><td>Light Cycler Software</td><td>Roche</td><td>480 SW 1.5.1</td><td></td></tr><tr><td>Modeling clay</td><td></td><td></td><td>no specific provider</td></tr><tr><td>King Fisher Flex Purification System</td><td>ThermoFisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aedes albopictus&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>eggs were collected in Freiburg, Germany</td></tr><tr><td>Binocular</td><td>MOTIC</td><td>SMZ-168</td><td></td></tr><tr><td>Binocular light</td><td>MOTIC</td><td>MLC-150C</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-Incubator</td><td>Thermo scientific</td><td>MIDI 40</td><td></td></tr></tbody></table>

forced salivation as a method to analyze vector competence of mosquitoes

Vektör yetkinlik bir sivrisinek yoluyla bulaşan virüs (mobovirus) omurgalı bir ana bilgisayara iletmek için potansiyel bir sivrisinek türün olarak tanımlanır. Uygun virüs parçacıkları virüslü bir sivrisinek tükürük yoluyla kan yemek sırasında iletilir. Zorla salya deneyleri tek sivrisinekler, hayvan deneyleri kullanımı kaçınarak temelinde vektör potansiyeli belirleme sağlar. Sivrisinekler bir deneyde kısa bir süre içinde çok sayıda analiz etmek uygun bir yöntemdir. Zorla salya deneyleri 856 bireysel sivrisinekler de dahil olmak üzere iki farklı Almanya'da tuzağa çözümlemek için kullanılan Culex pipiens pipiens biotypes, Culex torrentium yanı sıra deneysel olarak enfekte Aedes albopictus, Zika virüsü (ZIKV) ve 18 ° C veya 27 ° C iki ve üç hafta boyunca inkübe. Sonuçlar farklı Culex özellikleri vektör yetkinlik eksikliği için ZIKV belirtti. Buna ek olarak, Aedes albopictus duyarlı ZIKV için ama sadece 27 ° C'de, iletim hızları benzer şekilde paralel olarak test bir Aedes aegypti laboratuvar kolonisi ile.

En azından Aedes aegypti yetkili vektör olarak ZIKV için tropikal iklim koşulları12altında bilinir. Bu nedenle, biz Ae. aegypti olumlu bir denetim olarak tahlil oluşturmak ve vergi dairesi yanı sıra TRs bir kuluçka 27 ° C sıcaklık ve nem oranı % 80 çözümlemek için kullanılır. IR ve TR daha önce Fortuna ve arktarafından açıklandığı gibi tanımlanmış. 13. IR % 50 ve % 72 ve TR % 42 ve %31 14 ve 21 gün sonrası enfeksiyon (dpi), sırasıyla gösterdi meydan Ae. aegypti (Şekil 1A ve 1B). Daha sonra Avrupa sivrisinekler ZIKV enfeksiyon ve tropikal gibi ılıman iklim koşulları kullanarak iletme için test edildi.
27 ° C kuluçka sıcaklığında ZIKV enfeksiyon 14 dpi hem de 21 dpi, sadece 14 dpi çözünürlükte olumlu Cx. s. pipiens ve Cx. torrentium bireyler hariç tüm sivrisinek tür gösterdi. Bütün Aedes türlerin gösterdi (% 50 ve % 72 arasında) daha yüksek vergi dairesi yanı sıra yüksek viral RNA konsantrasyonu (106 109 RNA kopya/sivrisinek numuneler kadar) farklı Culex takson ile karşılaştırıldığında hangi 0 arasında değişen IRS ortaya % ve % 32 ve viral yük-in 103 -104 RNA kopya/sivrisinek örnekler. Culex takson tükürük örnekleri hiçbiri ZIKV (Şekil 1A ve 1B) içerdiği, ancak tüm Aedes türler ZIKV pozitif tükürük (TR 13-%42), görüntülenen. İlginçtir, iletim hızları 21 dpi (% 30) Almanya'dan Ae. aegypti ve Ae. albopictus benzer, ama (% 13) önemli ölçüde Ae. albopictus İtalya'dan daha düşük idi.
Kuluçka orta sıcaklık 18 ° c meydan sivrisinek genellikle Aedes türler (104–106 RNA kopya/sivrisinek) yanı sıra farklı Culex takson (102 –104 alt virüs yükler ortaya RNA kopya/sivrisinek). Ancak, 18 ° C kuluçka sıcaklığında ZIKV iletimini herhangi bir soruşturma sivrisinek türler için gözlendi değil.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57980/57980fig1.jpg"> Şekil 1: iletim hızları deneysel olarak ZIKV ile enfekte sivrisinek. Çalışmaların sonuçları vektör yeterlilik ZIKV ile farklı sivrisinek türler. Altı farklı sivrisinek takson ZIKV ile enfekte ve 27 ° C veya 18 ° C 14(a)veya (B) 21 gün inkübe edildi. TR sivrisinek ZIKV pozitif tükürük sayısına göre ZIKV-pozitif sivrisinek organları ile sayısı olarak tanımlanır. Soruşturma sivrisinekler toplam sayısı 856, en az 30 bireylerin her zaman noktası/sıcaklık/sivrisinek takson için yapıldı. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57980/57980fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes at JoVE.com

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Salya vektör yetkinlik sivrisinek analiz etmek için bir yöntem olarak zorla

Virüs iletim kaynaklı sivrisinek verimli kontrol ilgili sivrisinekler vektör potansiyelini bilgisine özel ilgi içindir. Biz zorla salya vektör yetkinlik Aedes albopictus ve üç farklı Culex takson Zika virüs iletimi için analiz etmek için bir yöntem olarak tanımlamak.

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

forced-salivation-as-method-to-analyze-vector-competence

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K Görüntüleme.  Bernhard Nocht Institute for Tropical Medicine. Virüs iletim kaynaklı sivrisinek verimli kontrol ilgili sivrisinekler vektör potansiyelini bilgisine özel ilgi içindir. Biz zorla salya vektör yetkinlik Aedes albopictus ve üç farklı Culex takson Zika virüs iletimi için analiz etmek için bir yöntem olarak tanımlamak.

Video: Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection. ATSs are derived from cDNA clones of mosquito-borne RNA viruses (genus Alphavirus; family Togaviridae). The Alphavirus genus contains about 30 different mosquito-borne virus species. Alphaviruses are enveloped viruses and contain single-stranded RNA genomes (~11.7 Kb). Alphaviruses transcribe a subgenomic mRNA that encodes the structural proteins of the virus required for encapsidation of the genome and maturation of the virus. Alphaviruses are usually highly lytic in vertebrate cells, but persistently infect susceptible mosquito cells with minimal cytopathology. These attributes make them excellent tools for gene expression in mosquito vectors. The most common ATSs in use are derived from Sindbis virus (SINV). The broad species tropism of SINV allows for infection of insect, avian, and mammalian cells8. However, ATSs have been derived from other alphaviruses as well9,10,20. Foreign gene expression is made possible by the insertion of an additional viral subgenomic RNA initiation site or promoter. ATSs in which an exogenous gene sequence is positioned 5' to the viral structural genes is used for stable protein expression in insects. ATSs, in which a gene sequence is positioned 3' to the structural genes, is used to trigger RNAi and silence expression of that gene in the insect.
ATSs have proven to be valuable tools for understanding vector-pathogen interactions, molecular details of viral replication and maintenance infectious cycles3,4,11,19,21. In particular, the expression of fluorescent and bioluminescent reporters has been instrumental tracking the viral infection in the vector and virus transmission5,14-16,18. Additionally, the vector immune response has been described using two strains of SINV engineered to express GFP2,9.
Here, we present a method for the production of SINV containing a fluorescent reporter (GFP) from the cDNA infectious clone. Infectious, full-length RNA is transcribed from the linearized cDNA clone. Infectious RNA is introduced into permissive target cells by electroporation. Transfected cells generate infectious virus particles expressing the GOI. Harvested virus is used to infect mosquitoes, as described here, or other host species (not shown herein). Vector competence is assessed by detecting fluorescence outside the midgut or by monitoring virus transmission7. Use of a fluorescent reporter as the GOI allows for convenient estimation of virus spread throughout a cell culture, for determination of rate of infection, dissemination in exposed mosquitoes, virus transmission from the mosquito and provides a rapid gauge of vector competence.

Methods for using alphavirus transducing systems to express fluorescent reporters in vitro and in adult mosquitoes are described. This technique may be adapted to express any protein of interest in lieu of or in addition to a reporter.

Alphavirus uyum Sistemi: Sivrisinek Vektörler Enfeksiyon görselleştirme için Araçlar

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Reproducible dsRNA Microinjection and Oviposition Bioassay in Mosquitoes and House Flies

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are delivered using a non-quantitative method. Accurate delivery of known quantities of nucleic acids or other chemicals is critical to measure the efficacy of the compound being tested and to allow reliable comparison between compounds.
Here we provide a reproducible, quantitative microinjection protocol that ensures accurate delivery of specific doses of dsRNA, reducing the mortality typically induced by injection injury. These modifications include the addition of Rhodamine B, a graduated injection needle, and an improved recovery method borrowed from Isoe and Collins. This method allows calculation of dose responses and facilitates comparisons between compounds. Versions of this method have been successfully used on three genera of mosquitoes as well as house flies to assess the reduction in fecundity resulting from gene silencing of ribosomal RNA transcripts.
This protocol provides strategies to reduce several challenges of small insect microinjection. Together, mechanical delivery of dsRNAs accompanied by visual verification, identification of effective locations for delivery, and inclusion of a post-injection recovery period ensure accurate dosing and low injury mortality. This protocol also describes an oviposition bioassay for uniform determination of effects on fecundity.

This protocol describes a microinjection methodology that we have standardized and used for several years to deliver specific quantities of nucleic acids directly to the hemolymph of mosquitoes and house flies. This protocol results in minimal injection mortality and allows dose correlated measurements of fecundity.

Tekrarlanabilir dsRNA mikroenjeksiyon ve Oviposition Bioassay sivrisinekler ve evi sinekler

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are ...

Çevre

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method requires a more technically demanding operation and involves complicated procedures, especially when used in larvae due to their small size, relatively thin and fragile cuticle, and high mortality, which limit its application. In contrast, viral vectors for gene delivery have been developed to surmount extracellular and intracellular barriers. These systems have the advantages of easy manipulation, high gene transduction efficiency, long-term maintenance of gene expression, and the ability to produce persistent effects in vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) are mosquito-specific, small single-stranded DNA viruses that can effectively deliver foreign nucleic acids into mosquito cells; however, the replacement or insertion of foreign genes to create recombinant viruses typically causes a loss of packaging and/or replication abilities, which is a barrier to the development of these viruses as delivery vectors.
Herein, we report using an artificial intronic small-RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. Detailed procedures for the construction, packaging and quantitative analysis of the rAaeDV vectors, and for larval infection are described.
This study demonstrates, for the first time, the feasibility of developing a non-defective recombinant MDV micro RNA (miRNA) expression system, and thus providing a powerful tool for the functional analysis of genes in mosquito and establishing a basis for the application of viral paratransgenesis for controlling mosquito-borne diseases. We demonstrated that Aedes albopictus 1st instar larvae could be easily and effectively infected by introducing the virus into the water body of the larvae breeding site and that the developed rAaeDVs could be used to overexpress or knock down the expression of a specific target gene in larvae, providing a tool for the functional analysis of mosquito genes.

We report using an artificial intronic small RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. A detailed procedure for the construction, packaging, and quantitative analysis of the rAaeDV vectors as well as for larval infection is described.

Sivrisinek larva genlerin fonksiyonel analiz için bir gen teslim vektör olarak rekombinant sivrisinek Densovirus kullanın

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

Gelişim Biyolojisi

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is based on the injection of non-pathogenic particles into insects, as the particles will be detected by the immune system and will induce the production of immune effectors. We focus here on the stimulation of the melanization response in the mosquito Anopheles gambiae. The melanization response results in the encapsulation of foreign particles and parasites with a dark layer of melanin. To stimulate this response, mosquitoes are inoculated with beads in the thoracic cavity using microcapillary glass tubes. Then, after 24 hr, the mosquitoes are dissected to retrieve the beads. The degree of melanization of the bead is measured using image analysis software. Beads do not have the pathogenic effects of parasites, or their capacity to evade or suppress the immune response. These injections are a way to measure immune efficacy and the impact of immune stimulations on other life history traits, such as fecundity or longevity. It is not exactly the same as directly studying host-parasite interactions, but it is an interesting tool to study immunity and its evolutionary ecology.

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

aşılanması<em&gt; Anofel gambiae</emMelanization Bağışıklık Tepkisi tetikleyebilecek ve Tedbir Boncuk&gt; ile Sivrisinekler

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is ...

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. However, effective malaria parasite targets for vaccine and chemotherapy development are still limited. This is largely due to the unavailability of relevant and practical in vivo infection models for human Plasmodium species, most notably for P.&#160;falciparum and P. vivax. Therefore, rodent malaria species have been extensively used as practical alternative in vivo models for malaria vaccine, drug targeting, immune response, and functional characterization studies of conserved Plasmodiumspp. genes. Indeed, rodent malaria models have proven to be invaluable, especially for exploring mosquito transmission and liver stage biology, and were indispensable for immunological studies. However, there are discrepancies in the methods used to evaluate the phenotypes of transgenic and wild-type asexual and sexual blood-stage parasites.&#160;Examples of these discrepancies are the choice of an intravenous vs. intraperitoneal infection of rodents with blood-stage parasites and the evaluation of male gamete exflagellation. Herein, we detail standardized experimental methods to evaluate the phenotypes of asexual and sexual blood stages in transgenic parasites expressing reporter-gene or wild-type rodent malaria parasite species. We also detail the methods to evaluate the phenotypes of malaria parasite mosquito stages (gametes, ookinetes, oocysts, and sporozoites) inside Anopheles mosquito vectors. These methods are detailed and simplified here for the lethal and non-lethal strains of P. berghei and P. yoelii but can also be applied with some adjustments to P. chabaudi and P. vinckei rodent malaria species.

Due to the striking similarities of the life cycle and biology of rodent malaria parasites to human malaria parasites, rodent malaria models have become indispensable for malaria research. Herein, we standardized some of the most important techniques used in the phenotypic analysis of wild-type and transgenic rodent malaria species.

Kemirgen Sıtma paraziti Asexual ve cinsel kan aşamaları ve sivrisinek aşamaları phenotypic Analizi

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Zika Virüsü Kullanan Aedes aegypti Sivrisineklerinde Vektör Yetkinlik Analizleri

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

Yetişkin Sivrisineklerde Oral Beslenme ve Mikroenjeksiyon ile Deneysel Viral Enfeksiyon

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

Yetişkin Anofeller gambiae Sivrisineklerine Etkili Oral RNA İnferferi (RNAi) Uygulaması

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

Biyoloji

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. Insecticide resistance surveillance of mosquito populations is typically done through Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bottle bioassays or World Health Organization (WHO) tube tests. However, these methods can result in a high degree of variability in mortality data due to variable insecticide contact with&#160;the insect, the relatively small numbers of organisms tested, extensive variation in mass between populations, and constantly changing environmental conditions, leading to variable outcomes. This paper presents the topical application bioassay, adapted as a high-throughput phenotypic bioassay for both mosquitoes and fruit flies, to test large numbers of insects along&#160;a range of insecticide concentrations.
This assay 1) ensures consistent treatment and insecticide contact with every organism, 2) produces highly specific dose-response curves that account for differences in average mass between strains and sexes (which is particularly important for field-collected organisms), and 3) allows for the calculation of statistically rigorous median lethal doses (LD50), which are necessary for resistance ratio comparisons-an alternative surveillance approach from diagnostic dose mortality, which is also used for larvicide resistance surveillance. This assay will be a complementary tool for accurately phenotyping mosquito populations and, as illustrated using fruit flies, is easily adaptable for use with other insects. We argue that this assay will help fill the gap between genotypic and phenotypic insecticide resistance in multiple insect species.

We describe the methodology and importance of the topical application bioassay to measure insecticide susceptibility in mosquitoes and fruit flies. The presented assay is high-throughput, utilizes insect mass-thus allowing for calculating a mass-relativized lethal dose instead of concentration-and likely has lower variability than other similar methods.

Sivrisinekler ve Meyve Sinekleri için İnsektisit Toksisitesini Ölçmek için Topikal Uygulama Biyotahlili

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

Topical Testing Assay: A Technique to Evaluate the Insecticidal Potential of Dopamine Receptor Antagonists on Adult Female Mosquitoes by Topical Application

Culture 3 to 5-day-old adult female mosquitoes in a 20-liter plastic cage. Label 9-ounce paper cups with the name and concentration of testing compound.
Next, prepare a 10 &#181;g/&#181;L stock solution of the testing compound in acetone in a 20-milliliter glass vial. Then, serially dilute the stock solution to obtain the desired working concentrations.
Clean a 1-milliliter glass syringe with acetone, and then, fill it with the test solution at the appropriate concentration. Secure the syringe in a micro-applicator, adjusted to deliver a volume of 0.25 microliters.
Next, use an aspirator to remove ten 3 to 5-day-old adult female mosquitoes from the cage, and anesthetize them for 5 minutes at 4 degrees Celsius. Then, transfer the mosquitoes to a Petri dish, and place the dish on ice for 10 minutes.
In order to avoid damaging the adult mosquito, which could contribute to mortality, ensure that they are not anesthetized in the fridge for more than 5 minutes, or immobilized on ice for more than 10, and minimize the handling of the mosquitoes. If you have access to a cold plate and a micromanipulator with a movable stage, that may further minimize handling of the mosquitoes.
Use fine tweezers to remove each mosquito from the dish. With the syringe micro-applicator, apply 0.25 microliters of testing solution to the dorsal thorax under a dissecting microscope. Next, transfer the mosquitoes to a labeled paper cup on ice. Seal the cup with a 10 by 10-centimeter mesh square, and a rubber band. Then, transfer it to the growth chamber, and record the number of dead mosquitoes.

Topikal Test Testi: Dopamin Reseptör Antagonistlerinin Yetişkin Dişi Sivrisinekler Üzerindeki İnsektisit Potansiyelini Topikal Uygulama ile Değerlendirme Tekniği