우리 감사 엘라 Weinert, 미셸 헬 름 및 우수한 기술 지원 Marlis Badusche, Culex 모기의 분석에 대 한 제시카 Börstler, 노르 베르트 베 커와 Björn Pluskota Aedes albopictus 계란과 올 리 Vapalahti에 대 한 제공에 대 한 바이러스 재고를 제공합니다. ML는 Leibniz 협회에 의해 지원 되었다 번호 보았다-2014-SGN-3을 부여 합니다.

1. 준비 여성 모기
<ol><li>흡 인기 (큰 감 금 소 당 약 400 모기)를 사용 하 여 큰 케이지에서 모기를 수집 합니다.</li>
	<li>7에 대 한 이산화탄소 (CO2)와 모기 anesthetize s.</li>
	<li>플라스틱 병 당 20 여성을 정렬 (Ø 50 m m × 100 mm). 참고: 모기 일어나, 다른 3 사용의 s2.
</li>
	<li>밤새 모기 굶 어.</li>
</ol>2. 인공 혈액 식사
참고: 모든 단계는 BSL-3 조건 하에서 수행 됩니다.
<ol><li>
전염 성 혈액 식사를 준비 합니다.
	<ol>
<li>1 x 108 플 라크 형성 단위 (PFU)의 농도에 바이러스 주식 희석 / mL. 참고: 재고 농도 조직 문화 감염 복용량 50 방법 (TCID50)를 수행 하 여 결정 되었고 Spearman & Kärber 알고리즘10,11계산.</li>
		<li>혼합 혈액 은행에서 인간의 혈액 (혈액 보존) 만료 (에 적합 하지 않은 모기에 대 한 유용 하지만, 더 이상 인간)과 당 (8% 솔루션), 만들어지고 소 혈 청 (FBS)와 바이러스의 작업 솔루션 (인간의 혈액:과 당: FBS 만료: 작업 솔루션 = 5:3:1:1). 참고: 우리 때문에 이것이 알려진된 자연 포유동물 호스트 ZIKV의 인간의 혈액 선택.</li>
	</ol>
</li>
	<li>혈액 식사 혼합 TCID50 통해 추가 분석을 위해의 140 µ L를 고정 합니다.</li>
	<li>
인공 먹이 종에 따라 다른 먹이 방법을 사용 하 여 수행.
	<ol>
<li>
Aedes aegypti: 막 먹이 30 분 (1 mL 당 급지대) 시스템을 사용 하 여.</li>
		<li>
Culex 종: 밤새 면 스틱을 통해 감염 혈액을 제공 하 고 피 (병 당 300 µ L) 따뜻한 하지 않습니다.</li>
		<li>
Aedes albopictus: 플라스틱 유리병으로 혈액 식사 혼합의 두 방울 (50 µ L 각)을 넣어 고 모기 2 h에 대 한 피드. 혈액 따뜻한 하지 않습니다. 참고: 모기는 첫번째 15 분에 공급 합니다. 연장된 보육 시간은 안전 상의 이유로 인해 필요 합니다. 혈액 방울 2 h, 따라서 오염 위험의 정렬 하는 동안 감소 된다 모기 먹이 후 배수는 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>7 공동2 모기 anesthetize s. 참고: 경우 모기 일어나 사용 하 여 다른 3 CO2의 s.</li>
	<li>정렬 및 카운트 완전히 부풀어 오른 모기 새로운 유리병에.</li>
	<li>면 패드, 유리병 및 플러그 사이 (8% 솔루션)과 포화 상태를 추가 합니다.</li>
	<li>14 또는 21 일 동안 18 ° C 또는 80%의 습도에서 27 ° C의 지정 된 온도에서 모기를 유지.</li>
	<li>과 포화 목화 패드와 함께 모기를 피드. 모든 72 h 1.5 mL 유리병 당과 당 (8% 솔루션)의 보충 (20 모기까지 먹이 따라 속도, 단계 2.5 참조).</li>
</ol>3. 강제 14 또는 21 일에 타 액 분 비 분석 실험
참고: 모든 단계는 BSL-3 조건 하에서 수행 됩니다.
<ol><li>2 × 104 Vero 세포 씨앗/는 96에 잘 당 잘 성장 매체 (Dulbecco´s 수정이 글 중간 (DMEM) 3 %FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 mg/mL 스, 5 µ g/mL 암포 B, 2 mM L-글루타민 보충의 200 µ L 플레이트 1% 비 본질적인 아미노산 (NEAA), 1% 나트륨 pyruvate).</li>
	<li>
타 액 분 비 장치를 준비:
	<ol>
<li>30 °의 각에서 벤치에 제곱된 유리 접시 (20 × 20 cm)를 배치 합니다. 참고:이 안전 실험실에서 underpressure 때문. 접시는 수평 또는 수직, 액체 누출 됩니다.</li>
		<li>이중 양면된 접착 테이프는 유리 접시 위에 놓습니다.</li>
		<li>역할까지 모델링 점토 0.5 cm의 직경을 도달 하 고 가로 1cm 양면 접착 테이프에서 연결.</li>
		<li>10 µ L 필터 팁의 팁의 첫 번째 0.3 cm을 잘라. 참고: biosafety 실험실 외부 실험을 시작 하기 전에 이것을 준비 합시다.</li>
		<li>버퍼링 하는 인산 염 (PBS, pH 7.4)의 10 µ L로 필터 팁을 채우십시오.</li>
		<li>스티커 테이프 쪽으로 팁 모델링 점토에 필터 팁을 놓습니다.</li>
		<li>부드러운 압력으로 필터 팁 보안.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
모기를 준비:
	<ol>
<li>CO2모기 anesthetize</li>
		<li>다리와 날개 무력화 모기를 제거 합니다.</li>
		<li>필터 팁 위에 스티커 테이프에 생활 모기 시체를 수정 합니다.</li>
		<li>장소 필터 팁으로 부드럽게 코입니다.</li>
		<li>30 분에 대 한 타 액 분 비 분석 실험을 실행 합니다.</li>
		<li>필터 팁을 제거 하 고 점토와 테이프 폐기.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다. 타 액의 처리
참고: 단계 4.1-4.6.2 BSL-3 조건 하에서 수행 됩니다.
<ol><li>PBS의 10 µ L을 포함 하는 반응 튜브에 내용을 추방.</li>
	<li>부드럽게 혼합 하 고 사용 하 여 샘플 당 하나 잘 준비 96 잘 접시의 우물으로 콘텐츠를 전송.</li>
	<li>5% CO2와 37 ° C에서 7 일 동안 접시를 품 어.</li>
	<li>Cytopathic 효과 (CPE)의 존재에 대 한 셀을 확인 하는 쌍안경을 사용 합니다.</li>
	<li>잘 CPE에 대 한 긍정적인 경우에, RNA 추출에 대 한 반응 관에는 상쾌한 pipetting 140 µ L에 의해 수확.</li>
	<li>
RNA 추출 키트를 사용 하 여 RNA를 정화.
	<ol>
<li>AVL의 560 µ L로는 상쾌한의 믹스 140 µ L (바이러스 성 세포의 용 해 버퍼)를 버퍼링 하 고 실 온에서 10 분 동안 품 어.</li>
		<li>에탄올 (96%)와 소용돌이 샘플의 560 µ L를 추가 합니다. 참고: 샘플이이 단계 후 비활성화 하 고 BSL-3 실험실에서 출력 될 수 있습니다.</li>
		<li>피펫으로 630 µ L 열에 1 분 동안 6000 x g으로 원심 분리기 샘플의.</li>
		<li>여과 액을 피펫으로 열에 나머지 630 µ L 삭제 하 고는 원심 분리를 반복 합니다.</li>
		<li>RNA를 세척, 6000 x g 1 분에서 버퍼 1 열 및 분리기 세척의 500 µ L을 추가 하 여 열의 막에 바인딩된.</li>
		<li>컬렉션 튜브를 버리고 고 열 새로운 컬렉션 튜브를 합니다. 12500 x g 3 분 동안에 500 µ L 세척 버퍼 2와 원심 분리기를 추가 합니다.</li>
		<li>컬렉션 튜브를 버리고 고 열 1.5 mL 반응 관 합니다.</li>
		<li>차입 버퍼의 50 µ L을 추가 하 고 실 온에서 1 분 동안 품 어.</li>
		<li>1 분 동안 6000 x g 에서 centrifuge 고 열을 삭제.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실시간 정량 Pcr을 통해 ZIKV RNA에 대 한 샘플을 분석 합니다.</li>
</ol>5. 모기 시체의 처리
참고: 단계 5.1-5.5 BSL-3 조건 하에서 수행 됩니다.
<ol><li>모기의 시체를 제거 하 고 각 신체 반응 관에 배치. 참고:이 시점에서 실험을 일시 중지-80 ° c.에 샘플을 저장 하는</li>
	<li>반응 관에 균질 미디어 (어떤 supplementals 없이 DMEM)의 500 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>손 모터 믹서를 사용 하 여 본문을 균질 하 고 모든 샘플에 대 한 새로운 암 꽃 술을 사용 합니다.</li>
	<li>96 잘 접시 정화에 대 한에 homogenate의 200 µ L를 추가 합니다. 참고:이 시점에서 실험을 일시 중지-80 ° c.에 샘플을 저장 하는</li>
	<li>60 분 60 ° c.에 외피에 의해 접시를 비활성화</li>
	<li>자동화 된 핵 산 정화 하 여 RNA를 정화. 참고:이 시점에서 실험을 일시 중지-80 ° c.에 샘플을 저장 하는</li>
</ol>6입니다. 분석
<ol><li>실시간 정량 Pcr를 사용 하 여 바이러스 성 RNA 복사본 계량. 참고: RNA 복사본에는 모든 ZIKV 양성 모기 시체와 ZIKV 부정적인 모기를 포함 하지 않고 평균 했다.</li>
	<li>IR, ZIKV 양성 모기 시체 수가 먹이 여성 당 수로 정의 계산 합니다.</li>
	<li>TR, ZIKV 양성 수 ZIKV 양성 모기 시체의 타 액과 모기의 수를 계산 합니다. 전송 속도 없음 ZIKV 양성 기관과 종 온도 조합에 대 한 계산 되지 않을 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Musso, D., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus.">Zika Virus.</a> Clinical Microbiology Reviews. (3), 487-524 (2016).</li><li>Epelboin, Y., Talaga, S., Epelboin, L., Dusfour, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+An+updated+review+of+competent+or+naturally+infected+mosquitoes.">Zika virus: An updated review of competent or naturally infected mosquitoes.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (11), e0005933 (2017).</li><li>Aliota, M. T., Peinado, S. A., Osorio, J. E., Bartholomay, L. 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M., Turell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+American+Mosquitoes+for+Three+Strains+of+Zika+Virus.">Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), (2016).</li><li>Dubrulle, M., Mousson, L., Moutailler, S., Vazeille, M., Failloux, A. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus+and+Aedes+mosquitoes:+saliva+is+infectious+as+soon+as+two+days+after+oral+infection.">Chikungunya virus and Aedes mosquitoes: saliva is infectious as soon as two days after oral infection.</a> PLOS ONE. 4 (6), e5895 (2009).</li></ol>

저자는 공개 없다.

그것은 이전 강제 타 액 분 비와 함께 얻은 결과 고전 다시 먹이 실험6라인 표시 되었습니다. 그러나, 다시 실험을 먹이 강제 타 액 분 비의 우리의 제시 방법에서, 직접 타 액 분 비 활동 증거 또는 타 액의 릴리스를 모니터링 수는 없습니다. 증명 하기 위해 타 액 분 비 활동, 샘플 시험 될 수 있었다 다른 구성 요소는 타 액에 존재 하는 위해 (예., 단백질, 탄수화물, 등.). 또한, 추가 qPCRs 바이러스 성 RNA 사본의 감지를 수 있습니다. 그러나 이것은,, 셀 문화 분석 결과 매우 낮은 입자 번호 경우에 민감도 제한할 수 있습니다 다양 한 분석에 대 한 타 액 샘플의 분할 필요 합니다. 차례 차례로,이 과소 결정된 전송 속도의 발생할 수 있습니다.
재현 가능한 결과 위해 그것은 모든 모기는 실험의 끝까지 살아 남기 위해 필요한입니다. 이것은 시각적으로 모기의 몸 운동 활동을 모니터링 하 여 제어 됩니다. 또한, 주어진된 모기 종에 대 한 타 액 분 비 분석 실험의 원리 사용 제어 바이러스,이 특정 모기 종에 의해 전송 될 알려진 먹이로 테스트할 수 있다. 반대로, 실험에 도입 하는 모든 바이러스 감염 모기에서 테스트할 수 있다.
강제 타 액 분 비 분석 실험은 많은 이점이 있다. 모기의 높은 숫자를 동시에 제어 표준화 된 조건 하에서 기본 단일 표본에 동물 복지 규정9와 충돌 하지 않고 테스트할 수 있습니다.
메서드는 여러 실험실에 의해 사용 됩니다. 그러나, 정확한 설정을 달라질 수 있습니다, 실험실 사이 결과에 차이를 낼 수 있는. 하나의 중요 한 구성 요소는 유리14 또는 플라스틱15의 만들 수 있는 타 액을 수집 하는 모 세관. Biosafety 수준 3 insectary의 높은 안전 규정을 준수, 우리 플라스틱 필터 팁 대신 사용 유리 모 세관, 상해의 위험 감소. 또한, 필터 팁을 수집된 액체 쉽게 옮겨질 수는 피 펫을 사용 하 여 하는 이점이 있다.
여기에 제시 된 강제 타 액 분 비 분석 실험의 설치 두 조사 협력 및 업무 공유를 기반으로 합니다. 모기의 demobilizing 다른 동시에 강제 타 액 분 비 설치를 준비 하는 동안 한 사람에 의해 수행 됩니다. 이 크게 처리 시간을 단축 하 고 위험을 최소화 샘플의 철거 작업 환경 및 타 액 분 비 판 사이 변경으로 전환 필요 하지 않습니다. 또한, 제 대 직후 강제 타 액 분 비 장치에 모기를 배치 하는 수 있습니다. 처리 시간이 오히려 짧은 모기 성공적인 강제 타 액 분 비에 필수적 이다. 마지막으로, 모기는 모든 실험을 통해 운동에 대 한 직접 모니터링할 수 있습니다.
여기에 제시 된 타 액 분 비 분석 결과 모기 종의 벡터 잠재력에 통찰력을 얻을 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 몇 가지 구체적인 질문에 대답 (예., 척추 동물을 감염 하는 데 필요한 모기 물린의 숫자), 동물 실험 필요 수.

2015 년, Zika 바이러스 (ZIKV), 가족 Flaviviridae, 콜롬비아와 브라질에서 등장 하 고 주목할 만한 수의 전염병을 일으키는 아메리카 및 카리브 해, 급속 하 게 확산에 속하는 모기 품 어진 바이러스 (mobovirus) 관련 임상 케이스 microcephaly의 Guillain-바레 증후군1. 종의 Aedes aegypti , Aedes albopictus 모기 ZIKV2, 기본 및 보조 벡터 간주 됩니다 하지만 다른 종의 속 Aedes 또한 실험 벡터 능력3 입증 . Aedes 종 달리 Culex 종 지금까지 테스트의 대부분은 바이러스4전송 수 없습니다. 단지, Culex quinquefasciatus 에 대 한 데이터 제공 불확실 결과3. 현재, 정보 부족 한 모기 벡터 적성에 ZIKV에 대 한 온건한 온도 조건 하에서 (< 20 ° C). 그러나,이 정보는 중앙 유럽 등 온대 기후 지역에 가능한 퍼짐의 위험 평가 대 한 상당한.
ZIKV에 대 한 유능한 벡터는 취득 하 고, 유지 하 고, 증폭 하 고 마지막으로 바이러스를 전송 수 있습니다. 따라서, 테스트 모기 시체 또는 시체의 부분, 다리, midgut, 머리 또는 침 샘를 포함 하 여 ZIKV에 대 한 충분 하지 않습니다 벡터 역량을 확인 하. 그것은 출시 된 타 액 내 감염 성 바이러스 입자에 대 한 테스트 필수입니다. 벡터 역량 평가, 감염 율 (IR, 부풀어 오른된 모기의 수 ZIKV 양성 모기 시체의 수)와 전송 속도 (TR, ZIKV 양성 수 ZIKV 양성 모기 시체의 타 액과 모기의 수), 될 필요가 확인 했습니다. 모기의 국세청은 단순히 균질 화 모기는 역전사 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-정량)에 의해 다음에 의해 쉽게 분석 될 수 있다 ZIKV를 대상으로. 또한, 감염 모기 당 바이러스 복사본 번호를 확인 하 여 추가 특징 될 수 있습니다. 대조적으로, 전송 속도의 분석 개별 모기의 타 액에 있는 가능한 바이러스 입자의 검출에 의존합니다. 이 호스트5에 니의 분석 이어서 취약 호스트 동물에 감염 된 모기의 먹이로 달성 될 수 있다. 그러나,이 방법은 적당 한 모델 생물에 의존 하며 비용과 동물 복지 규정에 의해 제한 된. 전송 속도 분석 하기 위한 실험 동물의 사용을 방지 하 고 비용을 줄이기 위해 다시 먹이 시스템 인공 혈액 작은 물방울 되어를 사용 하 여 설명6. 그러나, 개인의 높은 숫자와 함께 개별 규모 테스트는 어렵고입니다. 개별 규모에 타 액 분 비 분석 결과의 첫 번째 설명 19667 에 출판 되었음 및 최근 몇 년 동안 강제 타 액 분 비 실험 방법의 선택 모기3,8의 벡터 역량을 평가 하 되 .
따라 중앙 유럽의 우리의 벡터 능력 연구에 모기 최근에 출판 된9, 앤더슨 외에서 보고 우리 강제 타 액 분 비를 설명. 몇 가지 수정 8 . 이 메서드는 표준화 하는 높은 처리량 높은 biosafety 수준 조건 (BSL-3)에서 실험 및 세포 기반 문화 분석 실험에 의해 활성 바이러스의 식별을 포함 수 있습니다. 여기에 설명 된 실험 856 모기를 포함 한다. 그들은 인공 혈액 식사에 의해 ZIKV에 감염 되었고 그 후 타 액에서 감염 성 바이러스 입자의 존재에 대 한 분석. 필드와 Ae aegypti 와 Culex pipiens pipiens biotype molestus (Cx. p. molestus)의 실험 구성 두 개의 오래 된 실험실 인구에 모기 잡은 Culex pipiens pipiens biotype pipiens (Cx. p. pipiens), Culex torrentium (Cx torrentium)와 두 개의 Ae albopictus 인구. 이탈리아에서 수집 된, 두 개의 Ae albopictus 인구 중 하나를 제외한 모든 모기 독일에서 수집 했다.

<table><tbody><tr><td>Inject+matic Sleeper</td><td>Inject+matic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bugdorm-1 Insect Rearing Cage</td><td>BugDorm Store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila cultivation tubes</td><td>carl roth</td><td>PK11.2</td><td>plastic vial for mosquitoes</td></tr><tr><td>Plug for drosophila cultivation tubes</td><td>carl roth</td><td>PK15.1</td><td></td></tr><tr><td>Constant climate chamber</td><td>Binder</td><td>KBF-240</td><td></td></tr><tr><td>Blood</td><td></td><td></td><td>banked human blood, expired, not usable for medical application</td></tr><tr><td>Dumont-Pincette Electronic SS</td><td>Dumont</td><td>B40c</td><td></td></tr><tr><td>Vero cells</td><td>BNITM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flash light aspirator</td><td>Bioquip</td><td>2809</td><td></td></tr><tr><td>double-sided adhesive tape</td><td></td><td></td><td>no specific provider</td></tr><tr><td>Gammex Powder-free gloves with AMT</td><td>Ansell</td><td></td><td>for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory</td></tr><tr><td>RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit</td><td>altona diagnostics</td><td>591013</td><td></td></tr><tr><td>MagMax Pathogen RNA/DNA Kit</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>4462359</td><td>RNA isolation of mosquito bodies</td></tr><tr><td>Qiamp viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td>RNA-Isolation of supernatant</td></tr><tr><td>filter tips (20 &amp;micro;L)</td><td>Sarstedt</td><td>701,116,210</td><td>Cut the first 3 mm of the tip</td></tr><tr><td>hand motor mixer</td><td>carl roth</td><td>sold out</td><td></td></tr><tr><td>micro pestles for hand motor mixer</td><td>carl roth</td><td>CXH8.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>P0403550</td><td></td></tr><tr><td>L Glutamine Penicilin/Streptomycin</td><td>PAN</td><td>P0819100</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>PAN</td><td>P06-0110</td><td></td></tr><tr><td>Fructose</td><td>carl roth</td><td>4981.5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>PAN</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvat</td><td>PAN</td><td>P0443100</td><td></td></tr><tr><td>MEM NAA</td><td>PAN</td><td>P0832100</td><td></td></tr><tr><td>Hemotek Feeder</td><td>Hemotek</td><td>PS6</td><td></td></tr><tr><td>Light Cycler</td><td>Roche</td><td>480 II</td><td></td></tr><tr><td>Light Cycler Software</td><td>Roche</td><td>480 SW 1.5.1</td><td></td></tr><tr><td>Modeling clay</td><td></td><td></td><td>no specific provider</td></tr><tr><td>King Fisher Flex Purification System</td><td>ThermoFisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aedes albopictus&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>eggs were collected in Freiburg, Germany</td></tr><tr><td>Binocular</td><td>MOTIC</td><td>SMZ-168</td><td></td></tr><tr><td>Binocular light</td><td>MOTIC</td><td>MLC-150C</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-Incubator</td><td>Thermo scientific</td><td>MIDI 40</td><td></td></tr></tbody></table>

forced salivation as a method to analyze vector competence of mosquitoes

벡터 적성 척추 호스트 모기 품 어진 바이러스 (mobovirus)를 전송 하는 모기의 잠재력으로 정의 됩니다. 가능한 바이러스 입자는 감염 된 모기의 타 액을 통해 혈액 식사 동안 전송 됩니다. 강제 타 액 분 비 분석 실험 동물 실험의 사용을 피하고 단일 모기 기초 벡터 잠재력을 결정 하실 수 있습니다. 메서드는 시간의 짧은 기간 내에 한 실험에서 모기의 많은 수를 분석 하는 적당 한. 강제 타 액 분 비 분석 실험 두 가지를 포함 하 여 독일에 갇혀 856 개별 모기를 분석 하는 데 사용 했다 Culex pipiens pipiens biotypes, 뿐만 아니라 실험적으로 감염 했다 Aedes albopictus Culex torrentium Zika 바이러스 (ZIKV)와 18 ° C에서 27 ° C 2, 3 주 동안 incubated 하 고. 결과 ZIKV에 대 한 다른 Culex taxa의 벡터 역량의 부족을 표시. 반면, Aedes albopictus 하지만 동시에 테스트 하는 Aedes aegypti 실험실 식민지와 유사한 전송 속도와 27 ° C에서 ZIKV에 취약 했다.

Aedes aegypti 알려져 있다 유능한 벡터로 ZIKV 이상 열 대 기후 조건12에서. 따라서, 우리 사용 Ae aegypti 긍정적인 컨트롤로 분석 결과 설정 하 고 국세청 27 ° C의 외피 온도 80%의 습도에서 TRs 분석. IR 및 TR 앞에서 설명한 포 외에 의해 정의 되었다. 13. 도전 Ae aegypti 각각 감염 (dpi), 게시 하는 IR 50%와 72%와 42%, 14, 21 일에 31%의 TR을 보여주었다 (그림 1A 및 1B). 그 후, 유럽 모기 ZIKV 감염 및 전송 뿐만 아니라 온화한 열 대 기후 조건을 사용 하 여 테스트 되었습니다.
27 ° C 부 화 온도에서 모든 모기 종 14 dpi 14 dpi만에서 긍정 했다 Cx. p. pipiens 및 Cx torrentium 개인을 제외 하 고 21 dpi에서 ZIKV 감염을 보였다. 모든 Aedes 종 높은 바이러스 성 RNA 농도 뿐만 아니라 높은 국세청 (사이 50% 및 72%)을 보였다 (106 109 RNA 복사본/모기 표본까지)는 0 사이 배열 하는 국세청을 밝혀 다른 Culex taxa에 비해 % 그리고 32%와 10 바이러스 부하3 104 RNA 복사본/모기 표본. 모든 Aedes 종 Culex taxa에서 타 액 샘플의 ZIKV (그림 1A 및 1B)을 포함 하는 반면 ZIKV 양성 침 (TR 13-42%), 표시. 흥미롭게도, 21 dpi에서 전송 속도 Ae aegypti 및 Ae albopictus 독일 (30%)에서 유사 했다 하지만 이탈리아에서 Ae albopictus 에 실질적으로 더 낮은 (13%) 했다.
인큐베이션 18 ° C의 적당 한 온도에 도전된 모기의 일반적으로 낮은 바이러스 로드 Aedes 종 (104– 106 RNA 복사본/모기) 뿐만 아니라 다른 Culex taxa (102-104 공개 RNA 복사본/모기). 18 ° C 부 화 온도에서 ZIKV의 전송 하지 조사 모기 종에 대 한 관찰 되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57980/57980fig1.jpg"> 그림 1: 전송 속도 ZIKV 실험적으로 감염 하는 모기의. 다른 모기 종에 ZIKV 가진 벡터 능력 학문의 결과. 6 다른 모기 taxa ZIKV에 감염 되었고 27 ° C 또는 18 ° C 14 (A) 또는 (B) 21 일 알을 품을. TR은 ZIKV 양성 수 ZIKV 양성 모기 시체의 타 액과 모기의 수로 정의 됩니다. 조사 하는 모기의 총 수는 856, 각 시간 포인트/온도/모기 taxa에 30 개인의 최소 이었다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57980/57980fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

모기의 벡터 역량을 분석 하는 방법으로 타 액 분 비를 강제

모기 품 어진 바이러스 전송의 효율적인 제어를 위해 각각 모기의 벡터 잠재력의 지식은 특정 관심의 이다. 우리는 Aedes albopictus Zika 바이러스의 전송에 대 한 3 개의 다른 Culex taxa의 벡터 역량을 분석 하는 방법으로 강제 타 액 분 비를 설명 합니다.

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

forced-salivation-as-method-to-analyze-vector-competence

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K 조회수.  Bernhard Nocht Institute for Tropical Medicine. 모기 품 어진 바이러스 전송의 효율적인 제어를 위해 각각 모기의 벡터 잠재력의 지식은 특정 관심의 이다. 우리는 Aedes albopictus Zika 바이러스의 전송에 대 한 3 개의 다른 Culex taxa의 벡터 역량을 분석 하는 방법으로 강제 타 액 분 비를 설명 합니다.

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Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection. ATSs are derived from cDNA clones of mosquito-borne RNA viruses (genus Alphavirus; family Togaviridae). The Alphavirus genus contains about 30 different mosquito-borne virus species. Alphaviruses are enveloped viruses and contain single-stranded RNA genomes (~11.7 Kb). Alphaviruses transcribe a subgenomic mRNA that encodes the structural proteins of the virus required for encapsidation of the genome and maturation of the virus. Alphaviruses are usually highly lytic in vertebrate cells, but persistently infect susceptible mosquito cells with minimal cytopathology. These attributes make them excellent tools for gene expression in mosquito vectors. The most common ATSs in use are derived from Sindbis virus (SINV). The broad species tropism of SINV allows for infection of insect, avian, and mammalian cells8. However, ATSs have been derived from other alphaviruses as well9,10,20. Foreign gene expression is made possible by the insertion of an additional viral subgenomic RNA initiation site or promoter. ATSs in which an exogenous gene sequence is positioned 5' to the viral structural genes is used for stable protein expression in insects. ATSs, in which a gene sequence is positioned 3' to the structural genes, is used to trigger RNAi and silence expression of that gene in the insect.
ATSs have proven to be valuable tools for understanding vector-pathogen interactions, molecular details of viral replication and maintenance infectious cycles3,4,11,19,21. In particular, the expression of fluorescent and bioluminescent reporters has been instrumental tracking the viral infection in the vector and virus transmission5,14-16,18. Additionally, the vector immune response has been described using two strains of SINV engineered to express GFP2,9.
Here, we present a method for the production of SINV containing a fluorescent reporter (GFP) from the cDNA infectious clone. Infectious, full-length RNA is transcribed from the linearized cDNA clone. Infectious RNA is introduced into permissive target cells by electroporation. Transfected cells generate infectious virus particles expressing the GOI. Harvested virus is used to infect mosquitoes, as described here, or other host species (not shown herein). Vector competence is assessed by detecting fluorescence outside the midgut or by monitoring virus transmission7. Use of a fluorescent reporter as the GOI allows for convenient estimation of virus spread throughout a cell culture, for determination of rate of infection, dissemination in exposed mosquitoes, virus transmission from the mosquito and provides a rapid gauge of vector competence.

Methods for using alphavirus transducing systems to express fluorescent reporters in vitro and in adult mosquitoes are described. This technique may be adapted to express any protein of interest in lieu of or in addition to a reporter.

Alphavirus Transducing 시스템 : 모기 벡터의 감염을 떠올리을위한 도구

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

연구

면역학 및 감염병학

Reproducible dsRNA Microinjection and Oviposition Bioassay in Mosquitoes and House Flies

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are delivered using a non-quantitative method. Accurate delivery of known quantities of nucleic acids or other chemicals is critical to measure the efficacy of the compound being tested and to allow reliable comparison between compounds.
Here we provide a reproducible, quantitative microinjection protocol that ensures accurate delivery of specific doses of dsRNA, reducing the mortality typically induced by injection injury. These modifications include the addition of Rhodamine B, a graduated injection needle, and an improved recovery method borrowed from Isoe and Collins. This method allows calculation of dose responses and facilitates comparisons between compounds. Versions of this method have been successfully used on three genera of mosquitoes as well as house flies to assess the reduction in fecundity resulting from gene silencing of ribosomal RNA transcripts.
This protocol provides strategies to reduce several challenges of small insect microinjection. Together, mechanical delivery of dsRNAs accompanied by visual verification, identification of effective locations for delivery, and inclusion of a post-injection recovery period ensure accurate dosing and low injury mortality. This protocol also describes an oviposition bioassay for uniform determination of effects on fecundity.

This protocol describes a microinjection methodology that we have standardized and used for several years to deliver specific quantities of nucleic acids directly to the hemolymph of mosquitoes and house flies. This protocol results in minimal injection mortality and allows dose correlated measurements of fecundity.

재현할 수 dsRNA Microinjection 및 산란 검정 집 파리 모기에

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are ...

환경과학

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method requires a more technically demanding operation and involves complicated procedures, especially when used in larvae due to their small size, relatively thin and fragile cuticle, and high mortality, which limit its application. In contrast, viral vectors for gene delivery have been developed to surmount extracellular and intracellular barriers. These systems have the advantages of easy manipulation, high gene transduction efficiency, long-term maintenance of gene expression, and the ability to produce persistent effects in vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) are mosquito-specific, small single-stranded DNA viruses that can effectively deliver foreign nucleic acids into mosquito cells; however, the replacement or insertion of foreign genes to create recombinant viruses typically causes a loss of packaging and/or replication abilities, which is a barrier to the development of these viruses as delivery vectors.
Herein, we report using an artificial intronic small-RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. Detailed procedures for the construction, packaging and quantitative analysis of the rAaeDV vectors, and for larval infection are described.
This study demonstrates, for the first time, the feasibility of developing a non-defective recombinant MDV micro RNA (miRNA) expression system, and thus providing a powerful tool for the functional analysis of genes in mosquito and establishing a basis for the application of viral paratransgenesis for controlling mosquito-borne diseases. We demonstrated that Aedes albopictus 1st instar larvae could be easily and effectively infected by introducing the virus into the water body of the larvae breeding site and that the developed rAaeDVs could be used to overexpress or knock down the expression of a specific target gene in larvae, providing a tool for the functional analysis of mosquito genes.

We report using an artificial intronic small RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. A detailed procedure for the construction, packaging, and quantitative analysis of the rAaeDV vectors as well as for larval infection is described.

모기 유 충에서 유전자의 기능 분석에 대 한 유전자 납품 벡터로 재조합 모기 Densovirus의 사용

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

발생학

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is based on the injection of non-pathogenic particles into insects, as the particles will be detected by the immune system and will induce the production of immune effectors. We focus here on the stimulation of the melanization response in the mosquito Anopheles gambiae. The melanization response results in the encapsulation of foreign particles and parasites with a dark layer of melanin. To stimulate this response, mosquitoes are inoculated with beads in the thoracic cavity using microcapillary glass tubes. Then, after 24 hr, the mosquitoes are dissected to retrieve the beads. The degree of melanization of the bead is measured using image analysis software. Beads do not have the pathogenic effects of parasites, or their capacity to evade or suppress the immune response. These injections are a way to measure immune efficacy and the impact of immune stimulations on other life history traits, such as fecundity or longevity. It is not exactly the same as directly studying host-parasite interactions, but it is an interesting tool to study immunity and its evolutionary ecology.

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

접종<em&gt; 아노 펠 레스 gambiae</emMelanization 면역 반응을 유도하고 측정하는 비즈&gt; 모기

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is ...

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. However, effective malaria parasite targets for vaccine and chemotherapy development are still limited. This is largely due to the unavailability of relevant and practical in vivo infection models for human Plasmodium species, most notably for P.&#160;falciparum and P. vivax. Therefore, rodent malaria species have been extensively used as practical alternative in vivo models for malaria vaccine, drug targeting, immune response, and functional characterization studies of conserved Plasmodiumspp. genes. Indeed, rodent malaria models have proven to be invaluable, especially for exploring mosquito transmission and liver stage biology, and were indispensable for immunological studies. However, there are discrepancies in the methods used to evaluate the phenotypes of transgenic and wild-type asexual and sexual blood-stage parasites.&#160;Examples of these discrepancies are the choice of an intravenous vs. intraperitoneal infection of rodents with blood-stage parasites and the evaluation of male gamete exflagellation. Herein, we detail standardized experimental methods to evaluate the phenotypes of asexual and sexual blood stages in transgenic parasites expressing reporter-gene or wild-type rodent malaria parasite species. We also detail the methods to evaluate the phenotypes of malaria parasite mosquito stages (gametes, ookinetes, oocysts, and sporozoites) inside Anopheles mosquito vectors. These methods are detailed and simplified here for the lethal and non-lethal strains of P. berghei and P. yoelii but can also be applied with some adjustments to P. chabaudi and P. vinckei rodent malaria species.

Due to the striking similarities of the life cycle and biology of rodent malaria parasites to human malaria parasites, rodent malaria models have become indispensable for malaria research. Herein, we standardized some of the most important techniques used in the phenotypic analysis of wild-type and transgenic rodent malaria species.

설치류 말라리아 기생충 무성 및 성적 혈액 단계 및 모기 단계의 현상형 분석

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

지카 바이러스를 사용하여 Aedes aegypti 모기에 벡터 역량 분석

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

경구 수유 및 미세 주입에 의한 성인 모기의 실험적 바이러스 감염

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

성인 Anopheles 감비아 모기에 효과적인 경구 RNA 간섭 (RNAi) 투여

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

생물학

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. Insecticide resistance surveillance of mosquito populations is typically done through Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bottle bioassays or World Health Organization (WHO) tube tests. However, these methods can result in a high degree of variability in mortality data due to variable insecticide contact with&#160;the insect, the relatively small numbers of organisms tested, extensive variation in mass between populations, and constantly changing environmental conditions, leading to variable outcomes. This paper presents the topical application bioassay, adapted as a high-throughput phenotypic bioassay for both mosquitoes and fruit flies, to test large numbers of insects along&#160;a range of insecticide concentrations.
This assay 1) ensures consistent treatment and insecticide contact with every organism, 2) produces highly specific dose-response curves that account for differences in average mass between strains and sexes (which is particularly important for field-collected organisms), and 3) allows for the calculation of statistically rigorous median lethal doses (LD50), which are necessary for resistance ratio comparisons-an alternative surveillance approach from diagnostic dose mortality, which is also used for larvicide resistance surveillance. This assay will be a complementary tool for accurately phenotyping mosquito populations and, as illustrated using fruit flies, is easily adaptable for use with other insects. We argue that this assay will help fill the gap between genotypic and phenotypic insecticide resistance in multiple insect species.

We describe the methodology and importance of the topical application bioassay to measure insecticide susceptibility in mosquitoes and fruit flies. The presented assay is high-throughput, utilizes insect mass-thus allowing for calculating a mass-relativized lethal dose instead of concentration-and likely has lower variability than other similar methods.

모기 및 초파리에 대한 살충제 독성을 정량화하기위한 국소 응용 생물 검정

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

Topical Testing Assay: A Technique to Evaluate the Insecticidal Potential of Dopamine Receptor Antagonists on Adult Female Mosquitoes by Topical Application

Culture 3 to 5-day-old adult female mosquitoes in a 20-liter plastic cage. Label 9-ounce paper cups with the name and concentration of testing compound.
Next, prepare a 10 &#181;g/&#181;L stock solution of the testing compound in acetone in a 20-milliliter glass vial. Then, serially dilute the stock solution to obtain the desired working concentrations.
Clean a 1-milliliter glass syringe with acetone, and then, fill it with the test solution at the appropriate concentration. Secure the syringe in a micro-applicator, adjusted to deliver a volume of 0.25 microliters.
Next, use an aspirator to remove ten 3 to 5-day-old adult female mosquitoes from the cage, and anesthetize them for 5 minutes at 4 degrees Celsius. Then, transfer the mosquitoes to a Petri dish, and place the dish on ice for 10 minutes.
In order to avoid damaging the adult mosquito, which could contribute to mortality, ensure that they are not anesthetized in the fridge for more than 5 minutes, or immobilized on ice for more than 10, and minimize the handling of the mosquitoes. If you have access to a cold plate and a micromanipulator with a movable stage, that may further minimize handling of the mosquitoes.
Use fine tweezers to remove each mosquito from the dish. With the syringe micro-applicator, apply 0.25 microliters of testing solution to the dorsal thorax under a dissecting microscope. Next, transfer the mosquitoes to a labeled paper cup on ice. Seal the cup with a 10 by 10-centimeter mesh square, and a rubber band. Then, transfer it to the growth chamber, and record the number of dead mosquitoes.