Name: forced salivation as a method to analyze vector competence of mosquitoes
Uploaded: 2018-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
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Agradecemos a Ella Weinert, Michelle Helms e Marlis Badusche para obter assistência técnica excelente, Jessica Börstler para análises de mosquitos Culex , Norbert Becker e Björn Pluskota para o fornecimento de ovos de Aedes albopictus e Olli Vapalahti para fornecendo o estoque de vírus. ML foi apoiada pela Associação de Leibniz; conceda número Serra-2014-SGN-3.

1. prepare mosquitos fêmeas
<ol><li>Recolha os mosquitos de uma gaiola grande, usando um aspirador (aproximadamente 400 mosquitos por gaiola grande).</li>
	<li>Anestesiar os mosquitos com dióxido de carbono (CO2) para 7 s.</li>
	<li>Classificar 20 fêmeas por frasco plástico (Ø 50 mm × 100 mm). Nota: Se os mosquitos acordar, use outro 3 s de CO2.
</li>
	<li>Morrer de fome os mosquitos durante a noite.</li>
</ol>2. farinha de sangue artificial
Nota: Todas as etapas são realizadas sob condições de BSL-3.
<ol><li>
Prepare a refeição de sangue infecciosa.
	<ol>
<li>Diluir o estoque de vírus na concentração de 1 x 108 placa formando unidades (PFU) / mL. Nota: A concentração das ações foi determinada através da realização de cultura de tecidos método de dose 50 infecção (TCID50) e calculada pelo Spearman & Karber algoritmo10,11.</li>
		<li>Mix expirou sangue humano (preservação de sangue) no banco de sangue (não é adequado para humano, mas é útil para mosquitos) com frutose (8% solução), filtrado de soro bovino (FBS) e solução de trabalho do estoque de vírus (expirou sangue humano: frutose: FBS: solução de trabalho = 5:3:1:1). Nota: Nós escolhemos sangue humano, porque este é o host conhecido mamífero natural de ZIKV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Congele a 140 µ l da mistura de farinha de sangue para posterior análise através de TCID50.</li>
	<li>
Realize alimentação artificial usando métodos de alimentação diferentes, dependendo da espécie:
	<ol>
<li>
Aedes aegypti: Use uma membrana que alimentam o sistema por 30 min (1 mL por alimentador).</li>
		<li>
Culex spp.: fornecem o sangue infeccioso através de um stick de algodão durante a noite e não aquecer o sangue (300 µ l por frasco).</li>
		<li>
Aedes albopictus: Coloque duas gotas (50 µ l cada) da mistura de farinha de sangue num frasco de plástico e deixe os mosquitos alimentar por 2 h. Não aquecer o sangue. Nota: Os mosquitos irão alimentar nos primeiro 15 min. O tempo de incubação prolongada é necessário devido a razões de segurança. As gotas de sangue são drenadas depois alimentado de 2 h, que assim, reduzir o risco de contaminação durante a triagem dos mosquitos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anestesiar os mosquitos com CO2 para 7 s. Nota: Se os mosquitos acordar, use outro 3 s de CO2.</li>
	<li>Classificação e contagem totalmente ingurgitadas mosquitos dentro de um frasco de novo.</li>
	<li>Adicione uma almofada de algodão, saturada com frutose (8% solução) entre o frasco e um plug.</li>
	<li>Mantém os mosquitos à temperatura designada de 18 ° C ou a 27 ° C, na umidade de 80% para 14 ou 21 dias.</li>
	<li>Alimente os mosquitos com almofadas de algodão saturado de frutose. Reabastecer a cada 72 h com 1,5 mL de frutose (8% solução) por frasco (até 20 mosquitos, dependendo a alimentação taxa, consulte a etapa 2.5).</li>
</ol>3. forçado a salivação ensaio no dia 14 ou 21
Nota: Todas as etapas são realizadas sob condições de BSL-3.
<ol><li>2 x 104 células de Vero de semente / por bem em um 96 bem placa com 200 µ l de meio de crescimento (modificado de Dulbecco´s eagle suplementado (DMEM) com 3% FBS, 100 U/mL penicilina, estreptomicina 100 mg/mL, 5 µ g/mL, anfotericina B, 2 mM L-glutamina 1% não aminoácidos essenciais (timina), piruvato de sódio 1%).</li>
	<li>
Prepare o dispositivo salivação:
	<ol>
<li>Coloque uma placa de vidro quadrada (20 × 20 cm) no banco em um ângulo de 30°. Nota: Isto é necessário devido a sub-pressão no laboratório de segurança. Se a placa for horizontal ou vertical, o líquido irá vazar.</li>
		<li>Coloque a fita de adesivo dupla face em cima da placa de vidro.</li>
		<li>Papel a argila de modelagem até que ela atinge um diâmetro de 0,5 cm e anexá-lo horizontalmente 1 cm a fita adesiva de dupla face.</li>
		<li>Corte o primeiro 0,3 cm da ponta de uma ponta do filtro de 10 µ l. Nota: É aconselhável preparar isto antes de iniciar o experimento fora do laboratório de biossegurança.</li>
		<li>Encha as filtro dicas com 10 µ l de soro de tampão fosfato (PBS, pH 7,4).</li>
		<li>Coloque as pontas de filtro sobre a argila de modelagem com a ponta em direção a fita-cola.</li>
		<li>Segura as pontas do filtro com uma pressão suave.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prepare os mosquitos:
	<ol>
<li>Anestesia os mosquitos com CO2.</li>
		<li>Retire as pernas e as asas para imobilizar os mosquitos.</li>
		<li>Corrigi o mosquito vivos corpos sobre a fita-cola acima uma ponta do filtro.</li>
		<li>Coloque o narigudo suavemente a ponta do filtro.</li>
		<li>Execute o ensaio de salivação durante 30 min.</li>
		<li>Retire as pontas do filtro e descarte o barro e a fita.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. processamento de Saliva
Nota: Etapas 4.1 – 4.6.2 são executadas sob condições de BSL-3.
<ol><li>Expulse o conteúdo para os tubos de reação contendo 10 µ l de PBS.</li>
	<li>Misture delicadamente e transfira o conteúdo para os poços da placa 96 bem preparado usando um bem por amostra.</li>
	<li>Incube a placa por 7 dias a 37 ° C com 5% de CO2.</li>
	<li>Use o binóculo para marcar as células para a presença de efeito citopático (ECP).</li>
	<li>Se o poço é positivo para o CPE, recolher o sobrenadante por pipetagem µ l 140 em um tubo de reação para a extração de RNA.</li>
	<li>
Purifica o RNA usando um kit de extração de RNA.
	<ol>
<li>Mix 140 µ l do sobrenadante com 560 µ l de AVL buffer (tampão de Lise viral) e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
		<li>Adicione 560 µ l de etanol (96%) e a amostra de vórtice. Nota: As amostras são inactivadas após esta etapa e podem ser descarregadas fora do laboratório BSL-3.</li>
		<li>Pipeta 630 µ l da amostra em uma coluna e centrífuga com 6.000 x g por 1 min.</li>
		<li>Descartar o filtrado, pipetar os restantes µ 630 l na coluna e repetir a centrifugação.</li>
		<li>Lave o RNA, vinculado à membrana da coluna, adicionando 500 µ l de tampão 1 para a coluna e o centrifugador de lavagem a 6.000 x g por 1 min.</li>
		<li>Descartar o tubo de coleta e colocar a coluna em um novo tubo de coleta. Adicione 500 µ l lavagem buffer 2 e centrifugar a 12.500 x g durante 3 min.</li>
		<li>Descartar o tubo de coleta e colocar a coluna em um tubo de reação de 1,5 mL.</li>
		<li>Adicionar 50 µ l de tampão de eluição e incubar durante 1 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugar a 6.000 x g por 1 min e em seguida, descartar a coluna.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analise as amostras para o RNA ZIKV via RT-qPCR.</li>
</ol>5. processamento de corpos de Mosquito
Nota: Etapas 5.1 – 5.5 são executadas sob condições de BSL-3.
<ol><li>Retire os corpos do mosquito e coloque cada corpo em um tubo de reação. Nota: É possível pausar o experimento neste ponto e armazenar as amostras a-80 ° C.</li>
	<li>Adicione 500 µ l de mídia de homogeneização (DMEM sem qualquer adendos) no tubo de reação.</li>
	<li>Homogeneizar o corpo usando batedeira motor e usar um pistilo novo para cada amostra.</li>
	<li>Adicione 200 µ l do homogeneizado em uma 96--placa para purificação. Nota: É possível pausar o experimento neste ponto e armazenar as amostras a-80 ° C.</li>
	<li>Desativar a placa de incubação para 60 min a 60 ° C.</li>
	<li>Purifica o RNA pela purificação automatizado do ácido nucleico. Nota: É possível pausar o experimento neste ponto e armazenar as amostras a-80 ° C.</li>
</ol>6. análise
<ol><li>Quantificar as cópias de RNA Viral usando RT-qPCR. Nota: As cópias de RNA foram em média sobre todos os corpos de mosquito ZIKV-positivo e sem incluir os mosquitos ZIKV negativo.</li>
	<li>Calcule o IR, definido como o número de corpos de mosquito ZIKV positivo por número de fêmeas alimentadas.</li>
	<li>Calcule a TR, definida como o número de mosquitos com saliva ZIKV positivo por número de corpos de mosquito ZIKV-positivo. A taxa de transmissão não pode ser calculada para combinações de temperatura-espécies com nenhum corpo de ZIKV-positivo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Musso, D., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus.">Zika Virus.</a> Clinical Microbiology Reviews. (3), 487-524 (2016).</li><li>Epelboin, Y., Talaga, S., Epelboin, L., Dusfour, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+An+updated+review+of+competent+or+naturally+infected+mosquitoes.">Zika virus: An updated review of competent or naturally infected mosquitoes.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (11), e0005933 (2017).</li><li>Aliota, M. T., Peinado, S. A., Osorio, J. E., Bartholomay, L. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+methods+for+determining+transmission+rates+in+vector+competence+studies+with+Culex+univittatus+and+West+Nile+and+Sindbis+viruses.">Comparison of three methods for determining transmission rates in vector competence studies with Culex univittatus and West Nile and Sindbis viruses.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 5 (1), 70-72 (1989).</li><li>Hurlbut, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+salivation+and+virus+transmission.">Mosquito salivation and virus transmission.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15 (6), 989-993 (1966).</li><li>Anderson, S. L., Richards, S. L., Smartt, C. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+French+Polynesian+Aedes+aegypti+and+Aedes+polynesiensis+for+Zika+Virus.">Vector Competence of French Polynesian Aedes aegypti and Aedes polynesiensis for Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), (2016).</li><li>Fortuna, C., Remoli, M. E., Di Luca, M., Severini, F., Toma, L., Benedetti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+studies+on+comparison+of+the+vector+competence+of+four+Italian+Culex+pipiens+populations+for+West+Nile+virus.">Experimental studies on comparison of the vector competence of four Italian Culex pipiens populations for West Nile virus.</a> Parasites &amp; Vectors. 8, 463 (2015).</li><li>Weger-Lucarelli, J., R&#252;ckert, C., Chotiwan, N., Nguyen, C., Garcia Luna, S. M., Turell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+American+Mosquitoes+for+Three+Strains+of+Zika+Virus.">Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), (2016).</li><li>Dubrulle, M., Mousson, L., Moutailler, S., Vazeille, M., Failloux, A. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus+and+Aedes+mosquitoes:+saliva+is+infectious+as+soon+as+two+days+after+oral+infection.">Chikungunya virus and Aedes mosquitoes: saliva is infectious as soon as two days after oral infection.</a> PLOS ONE. 4 (6), e5895 (2009).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Anteriormente mostrou que os resultados obtidos com salivação forçada são na linha clássica de experimentos re-alimentação6. No entanto, em experimentos de re-alimentação e em nosso método apresentado de salivação forçada, é impossível diretamente a prova de atividade de salivação ou monitorar a liberação de saliva. Para provar a atividade de salivação, as amostras podem ser testadas para outros componentes presentes na saliva (ex., proteínas, carboidratos, etc.). Além disso, qPCRs adicional seria permitir a detecção de cópias de RNA virais. Isto, no entanto, requer separação de amostras de saliva para diversas análises, que podem limitar a sensibilidade no ensaio de cultura celular, em caso de números de partículas muito baixa. Por sua vez, isso pode levar a uma subestimação das taxas de transmissão de determinado.
Para obter resultados reprodutíveis, é necessário garantir que todos os mosquitos ficar vivos até o final do experimento. Isso é controlado pelo monitoramento visualmente a atividade de movimento de corpo dos mosquitos. Além disso, o uso do princípio do ensaio salivação para uma espécie de mosquito determinado tem que ser testado por vírus de controle, que são sabidos para ser transmitido por esta espécie de mosquito específico de alimentação. Vice-versa, cada vírus introduzido um experimento tem que ser testado em um mosquito suscetível.
Ensaios de salivação forçado têm muitas vantagens. Elevado número de mosquitos pode ser testado simultaneamente em um único espécime base em condições controladas e padronizadas sem entrar em conflito com normas de bem-estar dos animais9.
O método é usado por vários laboratórios. No entanto, as configurações exatas podem ser diferentes, que pode levar a diferenças nos resultados entre os laboratórios. Um componente crítico é o capilar para coletar a saliva, que pode ser feita de vidro14 ou15de plástico. Para cumprir com as normas de alta segurança de um insetário de nível 3 de segurança biológica, usamos dicas de filtro plásticas em vez de capilares de vidro, reduzindo assim o risco de lesões. Além disso, o filtro dicas tem a vantagem que o líquido coletado pode ser facilmente transferido usando uma pipeta.
A instalação do forçada salivação ensaio apresentado aqui é baseada em dois investigadores trabalhando juntos e compartilhando direitos. Desmobilização do mosquito é executada por uma pessoa, enquanto o outro simultaneamente prepara a instalação forçada de salivação. Isto reduz tempo de manuseio e minimiza o risco da amostra como mudar entre a desmobilização-local de trabalho e a salivação-placa de comutação não é necessário. Além disso, ele permite colocar os mosquitos no dispositivo de salivação forçada imediatamente após a desmobilização. Este mosquito bastante curto tempo de tratamento é essencial para o sucesso salivação forçada. Por último, os mosquitos podem ser monitorados diretamente para motilidade durante todo o experimento.
O ensaio de salivação apresentado aqui é usado para obter insights sobre o potencial vetor de espécies de mosquito. No entanto, para responder a algumas outras questões específicas (ex., os números de picadas de mosquito que são necessários para infectar os vertebrados), animal experimentos ainda podem ser necessários.

Em 2015, vírus Zika (ZIKV), um vírus transmitidas por mosquitos (mobovirus) pertencente à família Flaviviridae, surgiu na Colômbia e no Brasil e espalhou-se rapidamente através das Américas e do Caribe, causando uma epidemia com um notável número de associados casos clínicos de microcefalia e síndrome de Guillain-Barré1. Mosquitos da espécie Aedes aegypti e Aedes albopictus são considerados os vetores primários e secundários de ZIKV2, mas outras espécies do género Aedes também provaram ter competência vetorial experimental3 . Em contraste com as espécies de Aedes , maior parte das espécies de Culex testadas até agora não é capazes de transmitir o vírus4. Apenas, os dados para o Culex quinquefasciatus fornecido resultados inconclusivos3. Neste momento, informação está faltando na competência de vetor mosquito para ZIKV sob condições de temperatura moderada (< 20 ° C). No entanto, esta informação é substancial para as avaliações de risco dos spreads possíveis para regiões com clima temperado como Europa Central.
Um vetor competente para ZIKV é capaz de adquirir, manter, ampliar e finalmente transmitir o vírus. Portanto, teste o mosquito corpos, ou partes dos corpos, incluindo pernas, intestino, cabeça ou glândulas salivares, para ZIKV não é suficiente para determinar a competência vetorial. É obrigatório para testar partículas infecciosas vírus dentro saliva lançado. Para avaliar a competência vetorial, tanto a taxa de infecção (IR, número de corpos de mosquito ZIKV positivo por número de mosquitos ingurgitados) e a taxa de transmissão (TR, número de mosquitos com saliva ZIKV positivo por número de corpos de mosquito ZIKV-positivo), tem que ser determinado. IRs de mosquitos podem ser facilmente analisados pelos mosquitos simplesmente homogeneização, seguidos de uma reação em cadeia da polimerase em tempo real de transcriptase reversa (RT-qPCR) segmentação ZIKV. Além disso, a infecção pode ser ainda mais caracterizada por determinar o número de cópias virais por mosquito. Em contraste, a análise das taxas de transmissão se baseia na detecção de partículas de vírus viável na saliva de mosquitos individuais. Isto pode ser conseguido pela alimentação dos mosquitos infectados em animais suscetíveis do hospedeiro, seguidos pela análise da virémia no anfitrião5. No entanto, esse método se baseia em organismos-modelo apropriado e é caro e restrito por normas de bem-estar animal. Para evitar o uso de animais de laboratório para a análise de taxas de transmissão e reduzir os custos, artificial, sistemas de re-alimentação usar sangue gotículas tem sido descrito6. No entanto, testes em escala individual, combinada com um elevado número de indivíduos é difícil e demorado. A primeira descrição de um ensaio de salivação na escala individual foi publicada em 19667 e durante os últimos anos, experiências de salivação forçada tornaram-se o método de escolha para avaliar a competência vetorial de mosquitos3,8 .
Com base no nosso estudo de competência vetorial de Europa Central mosquitos recentemente publicado9, descrevemos salivação forçada, conforme relatado por Anderson et al. 8 , com algumas modificações. Este método permite alto rendimento padronizado experiências sob condições de biossegurança de alto nível (BSL-3) e inclui a identificação do vírus ativo pelos ensaios de cultura à base de célula. Os experimentos descritos aqui incluem 856 mosquitos. Eles foram infectados com ZIKV por refeição de sangue artificial e posteriormente analisados para a presença de partículas infecciosas vírus na saliva. Os mosquitos introduzidos dois experimentos composta por laboratório há muito estabelecidas populações de Ae. aegypti e Culex pipiens pipiens biótipo molestus (Cx. p. molestus), bem como campo pego Culex pipiens pipiens biótipo pipiens (Cx. p. pipiens), Culex torrentium (Cx. torrentium) e duas populações de Ae. albopictus . Com exceção de uma das duas populações Ae. albopictus , que foi recolhida na Itália, todos os mosquitos foram coletados na Alemanha.

<table><tbody><tr><td>Inject+matic Sleeper</td><td>Inject+matic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bugdorm-1 Insect Rearing Cage</td><td>BugDorm Store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila cultivation tubes</td><td>carl roth</td><td>PK11.2</td><td>plastic vial for mosquitoes</td></tr><tr><td>Plug for drosophila cultivation tubes</td><td>carl roth</td><td>PK15.1</td><td></td></tr><tr><td>Constant climate chamber</td><td>Binder</td><td>KBF-240</td><td></td></tr><tr><td>Blood</td><td></td><td></td><td>banked human blood, expired, not usable for medical application</td></tr><tr><td>Dumont-Pincette Electronic SS</td><td>Dumont</td><td>B40c</td><td></td></tr><tr><td>Vero cells</td><td>BNITM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flash light aspirator</td><td>Bioquip</td><td>2809</td><td></td></tr><tr><td>double-sided adhesive tape</td><td></td><td></td><td>no specific provider</td></tr><tr><td>Gammex Powder-free gloves with AMT</td><td>Ansell</td><td></td><td>for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory</td></tr><tr><td>RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit</td><td>altona diagnostics</td><td>591013</td><td></td></tr><tr><td>MagMax Pathogen RNA/DNA Kit</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>4462359</td><td>RNA isolation of mosquito bodies</td></tr><tr><td>Qiamp viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td>RNA-Isolation of supernatant</td></tr><tr><td>filter tips (20 &amp;micro;L)</td><td>Sarstedt</td><td>701,116,210</td><td>Cut the first 3 mm of the tip</td></tr><tr><td>hand motor mixer</td><td>carl roth</td><td>sold out</td><td></td></tr><tr><td>micro pestles for hand motor mixer</td><td>carl roth</td><td>CXH8.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>P0403550</td><td></td></tr><tr><td>L Glutamine Penicilin/Streptomycin</td><td>PAN</td><td>P0819100</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>PAN</td><td>P06-0110</td><td></td></tr><tr><td>Fructose</td><td>carl roth</td><td>4981.5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>PAN</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvat</td><td>PAN</td><td>P0443100</td><td></td></tr><tr><td>MEM NAA</td><td>PAN</td><td>P0832100</td><td></td></tr><tr><td>Hemotek Feeder</td><td>Hemotek</td><td>PS6</td><td></td></tr><tr><td>Light Cycler</td><td>Roche</td><td>480 II</td><td></td></tr><tr><td>Light Cycler Software</td><td>Roche</td><td>480 SW 1.5.1</td><td></td></tr><tr><td>Modeling clay</td><td></td><td></td><td>no specific provider</td></tr><tr><td>King Fisher Flex Purification System</td><td>ThermoFisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aedes albopictus&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>eggs were collected in Freiburg, Germany</td></tr><tr><td>Binocular</td><td>MOTIC</td><td>SMZ-168</td><td></td></tr><tr><td>Binocular light</td><td>MOTIC</td><td>MLC-150C</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-Incubator</td><td>Thermo scientific</td><td>MIDI 40</td><td></td></tr></tbody></table>

forced salivation as a method to analyze vector competence of mosquitoes

Competência de vetor é definida como o potencial de uma espécie de mosquito para transmitir um vírus transmitidas por mosquitos (mobovirus) para um hospedeiro vertebrado. Partículas de vírus viáveis são transmitidas durante uma refeição de sangue através da saliva de um mosquito infectado. Ensaios de salivação forçada permitem determinar o potencial de vetor com base único mosquitos, evitando o uso de experiências com animais. O método é adequado para analisar um grande número de mosquitos em um experimento dentro de um curto período de tempo. Ensaios de salivação forçado foram usados para analisar 856 mosquitos individuais presos na Alemanha, incluindo dois diferentes biótipos de Culex pipiens pipiens , Culex torrentium , bem como Aedes albopictus, que foram infectados experimentalmente com vírus Zika (ZIKV) e incubados a 18 ° C ou 27 ° C, para duas e três semanas. Os resultados indicaram a falta de competência vetorial dos diferentes táxons Culex para ZIKV. Em contraste, o Aedes albopictus foi suscetível a ZIKV, mas apenas a 27 ° C, com taxas de transmissão semelhantes a uma colônia de laboratório Aedes aegypti testada em paralelo.

Aedes aegypti é conhecido como um vetor competente para ZIKV pelo menos sob condições climáticas tropicais12. Portanto, usamos Ae. aegypti como um controle positivo para estabelecer o ensaio e analisar a receita federal, bem como TRs em uma temperatura de incubação de 27 ° C e uma humidade de 80%. IR e TR... foram definidos conforme descrito por Fortuna et al. 13. desafiado Ae. aegypti mostrou IR de 50% e 72% e TR de 42% e 31% em 14 e 21 dias pós infecção (dpi), respectivamente (figura 1A e 1B). Posteriormente, mosquitos europeus foram testados para infecção ZIKV e transmissão usando condições climáticas tropicais, bem como temperadas.
A temperatura de incubação de 27 ° C, todas as espécies de mosquito mostraram infecção ZIKV 14 dpi, bem como 21 dpi, exceto Cx. pipiens p. e Cx. torrentium indivíduos, que foram positivos em 14 dpi apenas. Todas as espécies de Aedes mostraram maior IRs (entre 50% e 72%) bem como a maior concentração de RNA viral (106 até 10 amostras de9 RNA cópias/mosquito) em comparação com os diferentes táxons de Culex , que revelou o IRs que variam entre 0 % e 32% e cargas virais de 103 a 10 espécimes de cópias/mosquito4 RNA. Todas as espécies de Aedes exibido saliva ZIKV-positivo (TR 13 – 42%), Considerando que nenhuma das amostras de saliva de táxons o Culex contido ZIKV (figura 1A e 1B). Curiosamente, as taxas de transmissão em dpi 21 foram semelhantes nos Ae. aegypti e albopictus Ae... da Alemanha (30%), mas foram substancialmente menores em Ae. albopictus da Itália (13%).
Incubação de mosquitos desafiados a uma temperatura moderada de 18 ° C revelado geralmente baixa vírus carrega na espécie Aedes (4– 10 106 RNA cópias/mosquito), bem como dos diferentes táxons Culex (102-104 Cópias de RNA/mosquito). No entanto, a 18 ° C temperatura de incubação, transmissão de ZIKV não foi observada para qualquer das espécies de mosquito investigadas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57980/57980fig1.jpg"> Figura 1: taxas de transmissão de mosquitos infectados experimentalmente com ZIKV. Resultados de estudos de competência vetorial com ZIKV em espécies diferentes de mosquitos. Seis táxons diferentes mosquito foram infectados com ZIKV e incubados a 27 ° C ou ° C 18 para 14 (A) ou 21 dias (B). TR é definido como o número de mosquitos com saliva ZIKV positivo por número de corpos de mosquito ZIKV-positivo. O número total de mosquitos investigado foi 856, com um mínimo de 30 indivíduos por táxons de ponto/temperatura/mosquito cada vez. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57980/57980fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Forçado a salivação como um método para analisar a competência vetorial de mosquitos

Controlo eficaz de transmissão do vírus a cargo de mosquito, o conhecimento do potencial vetor de respectivos mosquitos é de particular interesse. Descrevemos a salivação forçada como um método para analisar a competência vetorial do Aedes albopictus e três táxons de Culex diferentes para a transmissão de vírus Zika.

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

forced-salivation-as-method-to-analyze-vector-competence

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K visualizações.  Bernhard Nocht Institute for Tropical Medicine. Controlo eficaz de transmissão do vírus a cargo de mosquito, o conhecimento do potencial vetor de respectivos mosquitos é de particular interesse. Descrevemos a salivação forçada como um método para analisar a competência vetorial do Aedes albopictus e três táxons de Culex diferentes para a transmissão de vírus Zika.

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Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection. ATSs are derived from cDNA clones of mosquito-borne RNA viruses (genus Alphavirus; family Togaviridae). The Alphavirus genus contains about 30 different mosquito-borne virus species. Alphaviruses are enveloped viruses and contain single-stranded RNA genomes (~11.7 Kb). Alphaviruses transcribe a subgenomic mRNA that encodes the structural proteins of the virus required for encapsidation of the genome and maturation of the virus. Alphaviruses are usually highly lytic in vertebrate cells, but persistently infect susceptible mosquito cells with minimal cytopathology. These attributes make them excellent tools for gene expression in mosquito vectors. The most common ATSs in use are derived from Sindbis virus (SINV). The broad species tropism of SINV allows for infection of insect, avian, and mammalian cells8. However, ATSs have been derived from other alphaviruses as well9,10,20. Foreign gene expression is made possible by the insertion of an additional viral subgenomic RNA initiation site or promoter. ATSs in which an exogenous gene sequence is positioned 5' to the viral structural genes is used for stable protein expression in insects. ATSs, in which a gene sequence is positioned 3' to the structural genes, is used to trigger RNAi and silence expression of that gene in the insect.
ATSs have proven to be valuable tools for understanding vector-pathogen interactions, molecular details of viral replication and maintenance infectious cycles3,4,11,19,21. In particular, the expression of fluorescent and bioluminescent reporters has been instrumental tracking the viral infection in the vector and virus transmission5,14-16,18. Additionally, the vector immune response has been described using two strains of SINV engineered to express GFP2,9.
Here, we present a method for the production of SINV containing a fluorescent reporter (GFP) from the cDNA infectious clone. Infectious, full-length RNA is transcribed from the linearized cDNA clone. Infectious RNA is introduced into permissive target cells by electroporation. Transfected cells generate infectious virus particles expressing the GOI. Harvested virus is used to infect mosquitoes, as described here, or other host species (not shown herein). Vector competence is assessed by detecting fluorescence outside the midgut or by monitoring virus transmission7. Use of a fluorescent reporter as the GOI allows for convenient estimation of virus spread throughout a cell culture, for determination of rate of infection, dissemination in exposed mosquitoes, virus transmission from the mosquito and provides a rapid gauge of vector competence.

Methods for using alphavirus transducing systems to express fluorescent reporters in vitro and in adult mosquitoes are described. This technique may be adapted to express any protein of interest in lieu of or in addition to a reporter.

Sistema Alphavirus Transdução: ferramentas para visualização de infecção em mosquitos vetores

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

Imunologia e Infecção

Reproducible dsRNA Microinjection and Oviposition Bioassay in Mosquitoes and House Flies

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are delivered using a non-quantitative method. Accurate delivery of known quantities of nucleic acids or other chemicals is critical to measure the efficacy of the compound being tested and to allow reliable comparison between compounds.
Here we provide a reproducible, quantitative microinjection protocol that ensures accurate delivery of specific doses of dsRNA, reducing the mortality typically induced by injection injury. These modifications include the addition of Rhodamine B, a graduated injection needle, and an improved recovery method borrowed from Isoe and Collins. This method allows calculation of dose responses and facilitates comparisons between compounds. Versions of this method have been successfully used on three genera of mosquitoes as well as house flies to assess the reduction in fecundity resulting from gene silencing of ribosomal RNA transcripts.
This protocol provides strategies to reduce several challenges of small insect microinjection. Together, mechanical delivery of dsRNAs accompanied by visual verification, identification of effective locations for delivery, and inclusion of a post-injection recovery period ensure accurate dosing and low injury mortality. This protocol also describes an oviposition bioassay for uniform determination of effects on fecundity.

This protocol describes a microinjection methodology that we have standardized and used for several years to deliver specific quantities of nucleic acids directly to the hemolymph of mosquitoes and house flies. This protocol results in minimal injection mortality and allows dose correlated measurements of fecundity.

Reprodutível dsRNA Microinjection e Bioassay de oviposição em mosquitos e moscas domésticas

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are ...

Ambiente

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method requires a more technically demanding operation and involves complicated procedures, especially when used in larvae due to their small size, relatively thin and fragile cuticle, and high mortality, which limit its application. In contrast, viral vectors for gene delivery have been developed to surmount extracellular and intracellular barriers. These systems have the advantages of easy manipulation, high gene transduction efficiency, long-term maintenance of gene expression, and the ability to produce persistent effects in vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) are mosquito-specific, small single-stranded DNA viruses that can effectively deliver foreign nucleic acids into mosquito cells; however, the replacement or insertion of foreign genes to create recombinant viruses typically causes a loss of packaging and/or replication abilities, which is a barrier to the development of these viruses as delivery vectors.
Herein, we report using an artificial intronic small-RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. Detailed procedures for the construction, packaging and quantitative analysis of the rAaeDV vectors, and for larval infection are described.
This study demonstrates, for the first time, the feasibility of developing a non-defective recombinant MDV micro RNA (miRNA) expression system, and thus providing a powerful tool for the functional analysis of genes in mosquito and establishing a basis for the application of viral paratransgenesis for controlling mosquito-borne diseases. We demonstrated that Aedes albopictus 1st instar larvae could be easily and effectively infected by introducing the virus into the water body of the larvae breeding site and that the developed rAaeDVs could be used to overexpress or knock down the expression of a specific target gene in larvae, providing a tool for the functional analysis of mosquito genes.

We report using an artificial intronic small RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. A detailed procedure for the construction, packaging, and quantitative analysis of the rAaeDV vectors as well as for larval infection is described.

Uso de um Mosquito recombinante Densovirus como um vetor de entrega do Gene para a análise funcional de Genes em larvas do Mosquito

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

Biologia do Desenvolvimento

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is based on the injection of non-pathogenic particles into insects, as the particles will be detected by the immune system and will induce the production of immune effectors. We focus here on the stimulation of the melanization response in the mosquito Anopheles gambiae. The melanization response results in the encapsulation of foreign particles and parasites with a dark layer of melanin. To stimulate this response, mosquitoes are inoculated with beads in the thoracic cavity using microcapillary glass tubes. Then, after 24 hr, the mosquitoes are dissected to retrieve the beads. The degree of melanization of the bead is measured using image analysis software. Beads do not have the pathogenic effects of parasites, or their capacity to evade or suppress the immune response. These injections are a way to measure immune efficacy and the impact of immune stimulations on other life history traits, such as fecundity or longevity. It is not exactly the same as directly studying host-parasite interactions, but it is an interesting tool to study immunity and its evolutionary ecology.

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

inoculando<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Os mosquitos com grânulos para induzir e medir a melanizacao Resposta Imunológica

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is ...

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. However, effective malaria parasite targets for vaccine and chemotherapy development are still limited. This is largely due to the unavailability of relevant and practical in vivo infection models for human Plasmodium species, most notably for P.&#160;falciparum and P. vivax. Therefore, rodent malaria species have been extensively used as practical alternative in vivo models for malaria vaccine, drug targeting, immune response, and functional characterization studies of conserved Plasmodiumspp. genes. Indeed, rodent malaria models have proven to be invaluable, especially for exploring mosquito transmission and liver stage biology, and were indispensable for immunological studies. However, there are discrepancies in the methods used to evaluate the phenotypes of transgenic and wild-type asexual and sexual blood-stage parasites.&#160;Examples of these discrepancies are the choice of an intravenous vs. intraperitoneal infection of rodents with blood-stage parasites and the evaluation of male gamete exflagellation. Herein, we detail standardized experimental methods to evaluate the phenotypes of asexual and sexual blood stages in transgenic parasites expressing reporter-gene or wild-type rodent malaria parasite species. We also detail the methods to evaluate the phenotypes of malaria parasite mosquito stages (gametes, ookinetes, oocysts, and sporozoites) inside Anopheles mosquito vectors. These methods are detailed and simplified here for the lethal and non-lethal strains of P. berghei and P. yoelii but can also be applied with some adjustments to P. chabaudi and P. vinckei rodent malaria species.

Due to the striking similarities of the life cycle and biology of rodent malaria parasites to human malaria parasites, rodent malaria models have become indispensable for malaria research. Herein, we standardized some of the most important techniques used in the phenotypic analysis of wild-type and transgenic rodent malaria species.

Análise fenotípica de roedores malária parasita assexuada e estágios do sangue sexual e estágios do mosquito

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Análises de competência vetorial sobre mosquitos Aedes aegypti que usam zika vírus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

Infecção viral experimental em mosquitos adultos por alimentação oral e microinjeção

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

Administração eficaz de interferência oral de RNA (RNAi) para mosquitos anofeeles gâmbias adultos

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

Biologia

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. Insecticide resistance surveillance of mosquito populations is typically done through Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bottle bioassays or World Health Organization (WHO) tube tests. However, these methods can result in a high degree of variability in mortality data due to variable insecticide contact with&#160;the insect, the relatively small numbers of organisms tested, extensive variation in mass between populations, and constantly changing environmental conditions, leading to variable outcomes. This paper presents the topical application bioassay, adapted as a high-throughput phenotypic bioassay for both mosquitoes and fruit flies, to test large numbers of insects along&#160;a range of insecticide concentrations.
This assay 1) ensures consistent treatment and insecticide contact with every organism, 2) produces highly specific dose-response curves that account for differences in average mass between strains and sexes (which is particularly important for field-collected organisms), and 3) allows for the calculation of statistically rigorous median lethal doses (LD50), which are necessary for resistance ratio comparisons-an alternative surveillance approach from diagnostic dose mortality, which is also used for larvicide resistance surveillance. This assay will be a complementary tool for accurately phenotyping mosquito populations and, as illustrated using fruit flies, is easily adaptable for use with other insects. We argue that this assay will help fill the gap between genotypic and phenotypic insecticide resistance in multiple insect species.

We describe the methodology and importance of the topical application bioassay to measure insecticide susceptibility in mosquitoes and fruit flies. The presented assay is high-throughput, utilizes insect mass-thus allowing for calculating a mass-relativized lethal dose instead of concentration-and likely has lower variability than other similar methods.

Bioensaio de aplicação tópico para quantificar toxicidade de inseticida para mosquitos e moscas de frutas

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

Topical Testing Assay: A Technique to Evaluate the Insecticidal Potential of Dopamine Receptor Antagonists on Adult Female Mosquitoes by Topical Application

Culture 3 to 5-day-old adult female mosquitoes in a 20-liter plastic cage. Label 9-ounce paper cups with the name and concentration of testing compound.
Next, prepare a 10 &#181;g/&#181;L stock solution of the testing compound in acetone in a 20-milliliter glass vial. Then, serially dilute the stock solution to obtain the desired working concentrations.
Clean a 1-milliliter glass syringe with acetone, and then, fill it with the test solution at the appropriate concentration. Secure the syringe in a micro-applicator, adjusted to deliver a volume of 0.25 microliters.
Next, use an aspirator to remove ten 3 to 5-day-old adult female mosquitoes from the cage, and anesthetize them for 5 minutes at 4 degrees Celsius. Then, transfer the mosquitoes to a Petri dish, and place the dish on ice for 10 minutes.
In order to avoid damaging the adult mosquito, which could contribute to mortality, ensure that they are not anesthetized in the fridge for more than 5 minutes, or immobilized on ice for more than 10, and minimize the handling of the mosquitoes. If you have access to a cold plate and a micromanipulator with a movable stage, that may further minimize handling of the mosquitoes.
Use fine tweezers to remove each mosquito from the dish. With the syringe micro-applicator, apply 0.25 microliters of testing solution to the dorsal thorax under a dissecting microscope. Next, transfer the mosquitoes to a labeled paper cup on ice. Seal the cup with a 10 by 10-centimeter mesh square, and a rubber band. Then, transfer it to the growth chamber, and record the number of dead mosquitoes.

Ensaio de teste tópico: uma técnica para avaliar o potencial inseticida de antagonistas do receptor de dopamina em mosquitos fêmeas adultas por aplicação tópica