Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH R01 AI46435) ve RMRCE (NIH AI065357) tarafından destekleniyor.

Aşağıdaki protokol Sindbis virüs MRE16 dayalı bir ATS üretimi ve kullanımı için yazılmıştır. ATS, sivrisinek vektörü Aedes aegypti GFP ifade etmek için tasarlanmıştır . alpha virüsleri bir dizi (Sindbis virüs, Chikungunya virüsü, O&#39;nyong nyong virüs, Batı at ensefaliti virüsü) Enfeksiyon cDNA klonları ATS (Tablo 1) olarak tasarlanmış olduğunu şu anda mevcuttur. En iyi sonuç için plazmid DNA istenmeyen rekombinasyon ve viral cDNA kaybı önlemek için EMİN yetkili bakteri (Stratagene / Agilent Technologies) gibi bakteri yükseltilir. Tüm bulaşıcı klon plazmid, ikinci tur transkripsiyon için sonunda tam uzunlukta genomik RNA transkripsiyonu ve 3 eşsiz bir kısıtlama endonükleaz viral cDNA sonu acil 5 bakteriyofaj T7 veya SP6 promoter var. Her bir şebeke için, kullanıcıların uygun bakteriyofaj DNA bağımlı RNA polimeraz ve viral RNA genomu in vitro transkripsiyon için benzersiz kısıtlama endonükleaz kullanmanız gerekir . 1. CDNA Aynısını Enfeksiyon RNA nesil. <ol><li> 20 adet 100 mcL reaksiyon XhoI restriksiyon enzimi ile (p5&#39;dsMRE16 / GFP) plazmid bulaşıcı bir klon 5μg Linearize. 2-3h inkübe 37 ° C </li><li> 50 mcL RNaz içermeyen su kullanarak spin kolon DNA salınımlı Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit alternatif arıtma protokolü kullanarak Lineerleştirilmiş DNA arındırın. Plazmid konsantrasyonu yaklaşık 1.0 mg / ml olmalıdır. </li><li> RNaz-free 0,2 ml PCR tüpü, set-up protokol başına Ambion MAXIscript Takımı kullanarak 50 mcL transkripsiyon reaksiyon aşağıdaki gibidir. <ul><li> 22.5 mcL RNaz ücretsiz dH 2 O <ul><li> 5.0 mcL Doğrusallaştırılmış DNA örneğinin (1.0 mikrogram / ml) </li><li> 2.5 mcL 10mM ATP </li><li> 2.5 mcL 10mM CTP </li><li> 2.5 mcL 10mM UTP </li><li> 2.5 mcL 1mm GTP </li><li> 2.5 mcL 10mM kap analog (m 7 G (5 &#39;) ppp (5) G) </li><li> 5.0 mcL 10X transkripsiyon tampon </li><li> 5.0 mcL T7 veya SP6 polimeraz karışımı </li></ul></li><li> 50.0 mcL Toplam </li></ul></li><li> 37 1 saat için transkripsiyon reaksiyonu inkübe ° C. Inkübasyondan sonra, BHK-21 hücre reaksiyonu elektroporasyon için hemen kullanılabilir olmalıdır. Elektroporasyon BHK-21 hücrelerinin hazırlanması inkübasyon transkripsiyon reaksiyonu sırasında başlamalıdır. </li></ol> 2. Enfeksiyon RNA Virüs Üretimi <ol><li> Konfluent 150 cm 2 (T-150) ATS ortalama balon BHK-21 hücreleri iki% 70-80 Trypsinize. </li><li> Tüm hücreleri 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarın. </li><li> Pelet 2000 rpm&#39;de santrifüj hücreleri, 10 dk, 4 ° C geleneksel bir masaüstü santrifüj. </li><li> Olmadan steril PBS yeniden süspanse hücreleri Mg + + ve Ca + +. Hücreler PBS ile üç defa yıkanır kadar 2.3 ve 2.4 adımları tekrarlayın. </li><li> % 10 FBS içeren pelet hücreleri 0.5 ml MEM tekrar </li><li> 10 mcL hücrelerin% 10 FBS 90 mcL MEM ile seyreltilir ve bir hemasitometre güvenebilirsiniz. Eğer gerekli MEM% 10 FBS içeren 2,5-12,5 x 10 7 hücre / mL seyreltik hücreleri. </li><li> Buz gibi 0.2 cm elektroporasyon küvet, 400 mcL hücre süspansiyonu ve 20 mcL transkripsiyon reaksiyonu ekleyin. Küvet gelen yoğuşma silin. </li><li> 450V, 1200Ω, 150 μF: iki kez küvet Darbe. Biz Electro Hücre Manipulator, Harvard Apparatus Model ECM630 kullanın. </li><li> Küvet tüm içeriğini% 10 FBS ile 5 ml MEM içeren bir 25 cm 2 doku kültürü şişesi içine yerleştirin. </li><li> % 5 CO 2 ile 37 ° C&#39;de inkübe balonuna (ler). </li><li> Dalgaboyu 460-490 nm, emisyon dalga boyu 510-550 nm veya filtre dsRed: uygun filtre seti (örneğin GFP filtre ters bir floresan mikroskop kullanılarak günlük enfeksiyon Monitör dalgaboyu 460-560 nm, emisyon dalga boyu =&gt; 590 nm). </li><li> Floresan enfeksiyon belirsiz ve / veya CPE şişesi boyunca görülebilir önerdiğinde, -80 gerekli ve mağaza olarak, kısım, balonun içeriği toplamak% 30 FBS eklemek ° C Eğer istenirse hücre lizatları (2000 rpm, 10 dakika, 4 ° C) FBS ek olarak önce santrifüj yoluyla temizlenir. </li><li> Passage sonraki kan beslenme deneyleri için virüs titresi artırmak için yeni bir balon hücreleri ile en az bir kere virüs. </li></ol> Sivrisinekler 3 başına os Enfeksiyon <ol><li> Kan (genellikle de fibrinated koyun kanı satın) ve adım 2.13 hücre kültürü elde virüs süspansiyonu birlikte karıştırın. Kan öğünde Final virüs titresi genellikle ~ 1x10 7 plak oluşturan birim (pfu) sivrisinek verimli midgut enfeksiyon / mL olmalıdır. Tıkamak, 5&#39;-trifosfat (ATP) adenozin sivrisinek teşvik etmek 0.02M bir final konsantrasyon eklenebilir. </li><li> Sivrisinekler olabiliryapay bir besleyici verimli kan beslemek için onları teşvik etmek için enfeksiyondan önce su ve şeker yoksun bırakılamaz. Mortaliteyi en aza indirmek için mahrumiyet süresi daha önce tesis edilmelidir. Times, sivrisinek türleri, bir başlangıç ​​noktası olarak insectary vb nem bağlıdır, şeker 24 yem ve su 12 saat önce kaldıracaktır. Bu protokol, 37 ° C su ile dolaşımdaki su ceketli cam feeders17 kullanır. Domuz bağırsak zarı (yani en bakkalları iyice kasa sosis yıkanmış), besleyici ve yemek odasının pipetlenir ağız üzerine yerleştirilir. Farklı vektör türleri için çeşitli tasarımlar, membranlar ve protokolleri mevcuttur. </li><li> Sivrisinekler kan ile tıkanmış sivrisinek seçmek için sıralanır. Engorged sivrisinek üstüne organze ile bir karton transfer ve sivrisinek 28 inkübe ° C,% 75-80 bağıl nem, GFP ifade için işlenmiş kadar. </li></ol> 4. Sivrisinekler, intratorasik Aşılama Intratorasik aşılama eklembacaklıların bulaşmasını için alternatif bir yöntemdir. Midgut yoluyla yayılması gerekli değildir bu yöntem kullanılır. (Yöntem aşağıda açıklanan ancak bu görsel deney tekniği değildir). <ol><li> Sivrisinek az sayıda (5-10), plastik tüp içine taşıyan holding kafeslerden aspire edilir. 15 dakika sivrisinekler soğuk ° C kapalı tutarak tüpler 4 alınacaktır. </li><li> 2 5 sivrisinek tüpten buz üzerinde duran bir cam petri üzerine dökülen olacaktır. Kullanımda değil veya sivrisinek hareket etmeye başlar Petri kabı kapağı yerleştirin. Sivrisinek taşınması sırasında, bakım değiştirilmekte olan sivrisineklerin sayıda parça sayısı ve tutmak için alınmalıdır. Sivrisinekler soğuk masaya dökülen, toplam sayısı bir laboratuar karşı kaydedilecektir. </li><li> Iğne Nanoject özel cam ve bir iğne çektirmenin kullanılarak kılcal boru eriterek hazırlanmıştır. </li><li> 69 nL inokulum teslimat için üreticinin talimatlarına göre Nanoject II mikroenjektör Kur. Iğne iğne hasarlı olup olmadığını böylece inokulum çizerken dikkatli olmak gerekir. </li><li> Diseksiyon mikroskop kullanarak, sivrisinek toraks içine iğne takın ve aşılama için Nanoject etkinleştirmek. Iğne sivrisinek tamamen nüfuz ve sivrisinek sonraki ölümle sonuçlanan, diğer tarafta çıkmak değildir, böylece sivrisinek aşılama zaman dikkatli olmak gerekir. Inokulum iğneden çıkarmadan önce girdiğinizden emin olmak için her sivrisinek kontrol edin. </li><li> Sivrisinek hala iğne kazığa ise aşılama sonra, pamuk veya diğer tüm zamanlarda bir tıpa ile takılı yan tarafındaki küçük bir delikten bir kağıt tutarak karton yerleştirin. </li><li> Sivrisinek dikkatle karton (yaklaşık 50 kadar karton başına), bant sivrisinek yanlışlıkla serbest bırakılmasını önlemek için mantar inoküle ve yer var. 28 ° C ve% 80 bağıl nem insectary daha inkübasyon önce güvenli bir holding bin karton yerleştirin. </li></ol> 5. Sivrisinekler, İzleme Enfeksiyon <ol><li> 4 ° C&#39;de yaklaşık 15 dakika boyunca sivrisinek hareketsiz tutarak karton kağıt yerleştirin. </li><li> Sivrisinek az sayıda (bir seferde 5-10), floresan mikroskop kullanmak için uyarlanmış bir ürperti tabloya aktarın. </li><li> Floresan varlığı ya da yokluğu dayalı sivrisinek inceleyin ve sıralama. Ayrıca, floresan yoğunluğu bir proxy kantitatif ölçümü gibi enfeksiyon olabilir. Midguts, tükürük bezleri gibi Sivrisinek doku, yağ vücut floresan disseke ve izlenir olabilir. </li><li> Eğer uygunsa, enfekte olmuş sivrisinek inkübasyon devam seçilen sivrisinek kağıt karton geri dönün. </li></ol> 6. İletim Assay (Virüs İletim sergilemek için Zorla Sekresyon) <ol><li> Önce 24 saat beslemek için şeker kaynağı sivrisinek mahrum. </li><li> Bacaklarını ve kanatlarını çıkartın </li><li> Bir ucunda, ısıtmalı çekti ve snipped olmuştur 50 mcL kılcal tüp, Cargille B Tipi immersiyon ya da% 10 serum sakaroz çözeltisini 3-5 mcL ekleyin. </li><li> Burnumun tüp içine yerleştirin. Yağ kullanıyorsanız, tükürük damlacıkları burnumun terlemek görülecektir. PBS içinde% 1 pilocarbine çözüm ve% 0.1 Tween 80 mcL uyarmak için toraks uygulanabilir. </li><li> 60-90 dakika sonra, sivrisinek kaldırmak ve gerekirse virüs izolasyonu için mağaza. </li><li> 100 mcL% 20 FBS-PBS içeren bir tüp santrifüj tüpten çözüm çıkarın. </li><li> Sonra steril filtre 0.2 mikron şırınga filtresi aracılığıyla inokulum ve kültür hücreleri enfekte etmek için filtrelenmiş inokulum kullanın. </li></ol> BİYOGÜVENLİK NOT: Bu protokol açıklarenfekte sivrisinek üreten belirlenmesi ve izlenmesi için bir yöntem. Fasiliteler (yani bir ürperti tablosu, çevreleme tesis, vb) ve IBC onayına dayanarak, sadece kaçmasını önlemek için kanatlarını ve bacaklarını ayıkladıktan sonra onları inceleyerek sınırlı olabilir. SINV-tabanlı ATS oluşturulur ve BSL2 bir ortamda kullanılabilir. ATS Chikungunya virüs ya da Batı at ensefaliti virüsler gibi diğer alpha virüsleri dayalı BSL3 tesisleri gerekecektir. 7. Temsilcisi Sonuçlar ATS 5&#39;dsMRE16 / GFP kullanarak bir marker gen (GFP) ifadesi bir bakış Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. BHK-21 ve C6/36 (Aedes albopictus) hücreleri GFP ekspresyonu enfeksiyon sonrası enfeksiyon 0.01 çokluğu 5&#39;dsMRE16 / GFP virüs hücreleri belirli zamanlarda Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Şekil 3, virüs, bir enfektif kan yemek boyunca teslim sivrisinek alphavirus ve ATS virüs enfeksiyonu genel bir bakış. Şekil 4 Aedes aegypti ağız enfeksiyonu takiben ATS virüs ~ 10 7 pfu / ml kan yemek hazırlama gösterir. Tüm vücut görünümü Epifloresans bir mikroskop kullanılarak (Şekil 5) Enfekte sivrisineğin ve 10 gün sonrası enfeksiyonu seçilen vücut parçaları. GFP Algılama ve her floresan işaretleyici gen (Şekil 6) ifade ATS 5&#39;dsMRE16 virüsü ile enfeksiyonu takiben enfekte sivrisinek midguts içinde dsRED. İletim tahlil 5&#39;dsMRE16 / GFP ATS virüsü (Şekil 7) ile enfekte sivrisinek kullanarak. Tablo 1: ATS henüz sivrisinek gen ekspresyonu için tasarlanmıştır. <table border="1"><tbody><tr><td>&nbsp; Alphavirus </td><td> ATS </td><td> Sivrisinek </td><td> Referans </td></tr><tr><td> Sindbis Virüs </td><td> TE / 3&#39;2J ve TE / 5&#39;2J </td><td> Aedes aegypti </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Ochlerotatus triseriatus </td><td> 13 </td></tr><tr><td></td><td> 3&#39;dsMRE16 ve 5&#39;dsMRE16 </td><td> A. aegypti </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Culex tritaeniorhynchus </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td> 5&#39;dsTR339 </td><td> A. AEG ypti </td><td> 2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chikungunya virüsü </td><td> 3&#39;dsCHIKV ve 5&#39;dsCHIKV </td><td> A. aegypti / A albopictus </td><td> 20 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> O&#39;nyong nyong virüsü </td><td> 5&#39;dsONNV </td><td> Anofel gambiae </td><td> 1,9 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Batı at ensefaliti virüsü </td><td> 5&#39;dsWEEV. McMillan </td><td> Culex tarsalis </td><td> Stauft ve ark. Yayınlanmamış </td></tr></tbody></table> Tablo 2 sivrisinek gen ekspresyonu için ATS kullanmanın avantajları / dezavantajları. <table border="1"><tbody><tr><td> Avantajları: </td></tr><tr><td> Yüksek titrede virüs hızlı bir şekilde üretim </td></tr><tr><td> Geniş ev sahibi aralığı (SINV) </td></tr><tr><td> Yüksek RNA replikasyon oranı </td></tr><tr><td> Yüksek transgen ekspresyon düzeyleri </td></tr><tr><td> Manipüle genlerin göreceli kolaylığı </td></tr><tr><td> Böceklerde istikrarlı, kalıcı gen ekspresyonu </td></tr><tr><td> Minimal patoloji böceklerde </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> Dezavantajları: </td></tr><tr><td> Kısa vadeli omurgalı hücrelerinde ifade modu </td></tr><tr><td> Omurgalı hücreler üzerinde güçlü sitopatik etkileri </td></tr><tr><td> Gen boyutu kısıtlamaları (&lt;1 kB&#39;lık, ideal) </td></tr><tr><td> Bazı alpha virüsleri BSL3 çevreleme </td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: p5&#39;dsMRE / GFP SINV ifade GFP kullanarak BHK-21 hücre ATS virüs üretim Genel Bakış. In vitro transkripsiyon ardından, genomik ATS RNA virüsü kurtarılır BHK-21 hücre içine electroporated. ATS Virüs daha sonra sivrisinek enfekte için kullanılabilir. SGP = subgenomic organizatörü. Üç ATS RNA türlerinin cel transkripsiyonuls, genomik, subgenomic 1 ve 2 RNA&#39;lar subgenomic. C (kapsid), E2 ve E1 glikoproteinler, bulaşıcı bir virüs ATS genomu üretmek için ile monte edilir. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2: İfade hücreleri SINV 5&#39;dsMRE16 / GFP virüs enfeksiyonunu takiben sivrisinek GFP (C6/36). <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3: Genel Bakış virüs iletim önde gelen sivrisinek ATS virüs enfeksiyonu. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4: ATS SINV bir enfektif kan yemek sivrisinek açığa 5&#39;dsMRE16 enfeksiyon. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5: 10 gün enfeksiyonu ATS SINV 5&#39;dsMRE16 / GFP enfeksiyon. GFP Tüm vücut algılama bu virüs midgut kaçtı ve ikincil dokulara dağıtılmıştır gösterir. Şekil aynı zamanda yaygın bir enfeksiyon göstergesidir seçilen vücut parçaları, GFP ifade gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6: ATS SINV 5&#39;dsMRE16 / GFP ve 5&#39;dsMRE16 / midguts belirli zamanlarda enfeksiyon sonrası dsRED enfeksiyon. Midguts genellikle erken, daha sonraki dönemlerde enfeksiyon sonrası posterior midgut yayılır kan yemek içeren virüs yuttuktan sonra enfeksiyon farklı odaklar var. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig7.jpg" alt="Şekil 7" /> Şekil 7: 8 gün sonrası enfeksiyon gibi erken bir zamanda ATS 5&#39;dsMRE16 / sivrisinek tükürük GFP Algılama. Testi ATS virüs ve 5&#39;dsMRE16 / GFP virüs stably sivrisinek ekstrensek kuluçka dönemi boyunca, GFP ifade gösterir iletim göstermek için tasarlanmıştır. Sol panelinde, kılcal bir tüp içine salivating bir sivrisinek gösterir, merkez paneli, 1 gün ve sağ panel 3 gün enfeksiyonu tükürük ile enfekte C6/36 hücreleri gösterir.

<ol>
	<li>Brault, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+patterns+of+o'nyong+nyong+virus+in+the+malaria-transmitting+mosquito+Anopheles+gambiae.">Infection patterns of o'nyong nyong virus in the malaria-transmitting mosquito Anopheles gambiae.</a> Insect Mol. Biol. 13, 625-625 (2004).</li><li>Campbell, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+uses+RNA+interference+in+defense+against+Sindbis+virus+infection.">Aedes aegypti uses RNA interference in defense against Sindbis virus infection.</a> BMC. Microbiol. 8, 47-47 (2008).</li><li>Cirimotich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+RNA+interference+increases+alphavirus+replication+and+virus-associated+mortality+in+Aedes+aegypti+mosquitoes.">Suppression of RNA interference increases alphavirus replication and virus-associated mortality in Aedes aegypti mosquitoes.</a> BMC. Microbiol. 9, 49-49 (2009).</li><li>Capurro, d. e. L. a. r. a., M, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-expressed,+recombinant+single-chain+antibody+blocks+sporozoite+infection+of+salivary+glands+in+Plasmodium+gallinaceum-infected+Aedes+aegypti.">Virus-expressed, recombinant single-chain antibody blocks sporozoite infection of salivary glands in Plasmodium gallinaceum-infected Aedes aegypti.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 427-427 (2000).</li><li>Foy, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+Sindbis+virus+transducing+system+and+its+characterization+in+three+Culicine+mosquitoes+and+two+lepidopteran+species.">Development of a new Sindbis virus transducing system and its characterization in three Culicine mosquitoes and two lepidopteran species.</a> Insect Mol. Biol. 13, 89-89 (2004).</li><li>Foy, B. D., Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphavirus+transducing+systems.">Alphavirus transducing systems.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 627, 19-19 (2008).</li><li>Franz, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+RNA+interference-based+resistance+to+dengue+virus+type+2+in+genetically+modified+Aedes+aegypti.">Engineering RNA interference-based resistance to dengue virus type 2 in genetically modified Aedes aegypti.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 4198-4198 (2006).</li><li>Hahn, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+Sindbis+virus+transient+expression+vectors+for+studying+antigen+processing+and+presentation.">Infectious Sindbis virus transient expression vectors for studying antigen processing and presentation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 2679-2679 (1992).</li><li>Keene, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+acts+as+a+natural+antiviral+response+to+O'nyong-nyong+virus+(Alphavirus;+Togaviridae)+infection+of+Anopheles+gambiae.">RNA interference acts as a natural antiviral response to O'nyong-nyong virus (Alphavirus; Togaviridae) infection of Anopheles gambiae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 17240-17240 (2004).</li><li>Lundstrom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+mammalian+membrane+proteins+in+mammalian+cells+using+Semliki+Forest+virus+vectors.">Expression of mammalian membrane proteins in mammalian cells using Semliki Forest virus vectors.</a> Methods Mol. Biol. 601, 149-149 (2010).</li><li>Myles, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphavirus-derived+small+RNAs+modulate+pathogenesis+in+disease+vector+mosquitoes.">Alphavirus-derived small RNAs modulate pathogenesis in disease vector mosquitoes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 19938-19938 (1993).</li><li>Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+resistance+to+dengue-2+virus+transmission+in+mosquitoes.">Genetically engineered resistance to dengue-2 virus transmission in mosquitoes.</a> Science. 272, 884-884 (1996).</li><li>Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+chloramphenicol+acetyltransferase+in+Aedes+albopictus+(C6/36)+cells+and+Aedes+triseriatus+mosquitoes+using+a+double+subgenomic+recombinant+Sindbis+virus.">The expression of chloramphenicol acetyltransferase in Aedes albopictus (C6/36) cells and Aedes triseriatus mosquitoes using a double subgenomic recombinant Sindbis virus.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 24, 39-39 (1994).</li><li>Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Sindbis+virus+expression+system+that+efficiently+expresses+green+fluorescent+protein+in+midguts+of+Aedes+aegypti+following+per+os+infection.">Development of a Sindbis virus expression system that efficiently expresses green fluorescent protein in midguts of Aedes aegypti following per os infection.</a> Insect Mol. Biol. 9, 57-57 (2000).</li><li>Parikh, G. R., Oliver, J. D., Bartholomay, L. C., C, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+haemocyte+tropism+for+an+arbovirus.">A haemocyte tropism for an arbovirus.</a> J. Gen. Virol. 90, 292-292 (2009).</li><li>Pierro, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+orally+infectious+Sindbis+virus+transducing+system+that+efficiently+disseminates+and+expresses+green+fluorescent+protein+in+Aedes+aegypti.">Development of an orally infectious Sindbis virus transducing system that efficiently disseminates and expresses green fluorescent protein in Aedes aegypti.</a> Insect Mol. Biol. 12, 107-107 (2003).</li><li>Rutledge, L. C. W. a. r. d., A, R., Gould, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+feeding+response+of+mosquitoes+to+nutritive+solutions+in+a+new+membrane+feeder.">Studies on the feeding response of mosquitoes to nutritive solutions in a new membrane feeder.</a> Mosq. News. 24, 407-407 (1964).</li><li>Sanders, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sindbis+virus+induces+transport+processes+and+alters+expression+of+innate+immunity+pathway+genes+in+the+midgut+of+the+disease+vector+Aedes+aegypti.">Sindbis virus induces transport processes and alters expression of innate immunity pathway genes in the midgut of the disease vector Aedes aegypti.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 35, 1293-1293 (2005).</li><li>Uhlirova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Sindbis+virus-mediated+RNA+interference+to+demonstrate+a+conserved+role+of+Broad-Complex+in+insect+metamorphosis.">Use of Sindbis virus-mediated RNA interference to demonstrate a conserved role of Broad-Complex in insect metamorphosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 15607-15607 (2003).</li><li>Vanlandingham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+double+subgenomic+chikungunya+virus+infectious+clone+to+express+heterologous+genes+in+Aedes+aegypti+mosquitoes.">Development and characterization of a double subgenomic chikungunya virus infectious clone to express heterologous genes in Aedes aegypti mosquitoes.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 35, 1162-1162 (2005).</li><li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+inducing+or+inhibiting+apoptosis+on+Sindbis+virus+replication+in+mosquito+cells.">Effects of inducing or inhibiting apoptosis on Sindbis virus replication in mosquito cells.</a> J. Gen. Virol. 89, 2651-2651 (2008).</li></ol>

Burada sunulan yöntemleri, araştırmacılar, bir sivrisinek hücre kültürü ve yetişkin dişi sivrisinek alphavirus bulaşmasına takip etmesini sağlayacak. ATS virüsler kullanmanın avantaj ve dezavantajları Tablo 2&#39;de özetlenmiştir. ATS bulaşıcı bir klon genetik olarak herhangi bir GOI ifade etmek için manipüle edilebilir ve tek zincir antikorlar, RNAi, bastırıcılar, endojen genlerin hedef antisens RNA&#39;lar ve pro-apoptotik proteinler ifade etmek için kullanılmıştır. Bir muhabir değilse, o zaman bu yöntemin görüntüleme bölümü ilgili değildir. Ancak, aynı protokolleri birçok ATS kurtarma virüs, yayılma ve sivrisinek enfeksiyon için gerekli. Bir alphavirus transducing sistemi takıldığında sınırlamalar transgen maksimum boyutu vardır. Boyutu kısıtlamaları ATS oluşturmak için kullanılan ebeveyn gerginlik bağlı olarak değişir, ancak ateşböceği lusiferaz gibi büyük muhabiri genler sivrisinek kullanmak için ATS yapımında kullanılmış olmasına rağmen 1KB genellikle. Viroloji arka plan mütevazı bir miktarda araştırma laboratuarları, bu protokoller aşağıdaki ATS kullanmak gerekir. Bir dizi araştırma laboratuarlarında zaten SINV tabanlı ATS kullanarak bunu yaptık.

<table><tbody><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>MAXIscript Kit</td><td>Ambion</td><td>AB1312</td><td>Be sure to use a kit containing the appropriate polymerase for your construct.</td></tr><tr><td>Cap Analogue (m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;G(5&amp;rsquo;)ppp(5&amp;rsquo;)G)</td><td>Ambion</td><td>AM8050</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II nanoliter injector</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Electro Cell Manipulator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>ECM 630</td><td></td></tr></tbody></table>

alphavirus transducing system:  tools for visualizing infection in mosquito vectors

Alphavirus transducing sistemleri (ATSs) enfeksiyonu sırasında ilgi (GOI) genleri ifade etmek için önemli araçlardır. ATSs sivrisinek yoluyla bulaşan RNA virüsleri cDNA klonları (aile Togaviridae cinsi Alphavirus) türetilmiştir. Alphavirus cins, yaklaşık 30 farklı sivrisinek yoluyla bulaşan virüs türleri içerir. Alpha virüsleri, zarflı virüslerdir ve tek iplikli RNA genomlar (~ 11.7 Kb) içerir. Alpha virüsleri subgenomic mRNA virüsün genom ve olgunlaşması encapsidation için gerekli olan virüs yapısal proteinleri kodlayan bir yazıya. Alpha virüsleri omurgalı hücreler genellikle yüksek parçalayıcı, ama ısrarla minimal sitopatoloji duyarlı sivrisinek hücreleri enfekte. Bu nitelikleri onları sivrisinek vektörleri gen ekspresyonu için mükemmel araçlardır olun. Kullanımı en yaygın ATSs Sindbis virüsü (SINV) türetilmiştir. SINV geniş türlerin tropizm enfeksiyon, böcek, kuş ve memeli cells8 sağlar. Ancak, ATSs iyi 9,10,20 gibi diğer alpha virüsleri elde edilmiştir. Yabancı gen ekspresyonu ek bir viral subgenomic RNA başlatılması sitesi veya organizatörü yerleştirilmesi ile mümkün olmaktadır. Dışsal bir gen dizisi viral yapısal genlerin 5 &#39;yerleştirilmiş olduğu ATSs böcekler istikrarlı protein ifade için kullanılır. Bir gen dizisi yapısal genler 3 &#39;yerleştirilmiş olduğu ATSs, RNAi ve sessizlik böcek bu genin ifade tetiklemek için kullanılır. ATSs vektör-patojen etkileşimleri, viral replikasyon moleküler ayrıntıları ve bakım bulaşıcı döngüleri 3,4,11,19,21 anlamak için değerli bir araç olduğu kanıtlanmıştır . Özellikle, floresan ve bioluminescent gazetecilere ifadesi, vektör ve virüs iletim 5,14-16,18 viral enfeksiyon izleme etkili olmuştur . Ayrıca, vektör bağışıklık yanıtı SINV GFP 2,9 ifade etmek için tasarlanmış iki suşları kullanılarak tarif edilmiştir. Burada, cDNA bulaşıcı klon floresan muhabiri (GFP) içeren SINV üretimi için bir yöntem mevcut. Lineerleştirilmiş cDNA klonu Enfeksiyon, tam uzunlukta RNA transkripsiyonu. Enfeksiyon RNA elektroporasyon izin hedef hücrelerin içine tanıtıldı. Transfekte hücreler GOI ifade bulaşıcı bir virüs parçacıkları üretir. Burada açıklandığı gibi sivrisinek, ya da diğer ev sahibi türleri (burada gösterilmemiştir) Hasat virüs bulaştırmak için kullanılır. Vektör yetki midgut dışında floresan tespit ederek veya izleme virüs iletim 7 değerlendirilir. GOI bir hücre kültürü boyunca, enfeksiyon, yaygınlaştırma sivrisinek maruz kalan sivrisinek, virüs iletim hızı tespiti için, virüsün yayılmasını rahat tahmin sağlar ve hızlı bir vektör yetkinlik göstergesi sağlar floresan muhabiri kullanın.

Watch this Scientific Journal Video about Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors at JoVE.com

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alphavirus uyum sistemlerini kullanarak in vitro ve erişkin sivrisinek floresan gazetecilere ifade etmek için yöntemler açıklanmıştır. Bu teknik, yerine ya da ek olarak bir muhabir ilgi herhangi bir protein ifade etmek için adapte olabilir.

Alphavirus uyum Sistemi: Sivrisinek Vektörler Enfeksiyon görselleştirme için Araçlar

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

alphavirus-transducing-system-tools-for-visualizing-infection

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.7K Görüntüleme.  Colorado State University. Alphavirus uyum sistemlerini kullanarak in vitro ve erişkin sivrisinek floresan gazetecilere ifade etmek için yöntemler açıklanmıştır. Bu teknik, yerine ya da ek olarak bir muhabir ilgi herhangi bir protein ifade etmek için adapte olabilir.

Video: Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Vero Hücre Kültür Testi ile Alan toplanan Sivrisinekler Enfeksiyon Virüs Algılama

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

Alexa Fluor Etiketleme Dang Virüs görselleştirme

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different downstream patient-to-patient transmission potentials, and require very different patient treatments. Thus, recent Zika outbreaks make it urgent to develop tools that rapidly discriminate these viruses in patients and trapped mosquitoes, to select the correct patient treatment, and to understand and manage their epidemiology in real time.
Unfortunately, current diagnostic tests, including those receiving 2016 emergency use authorizations and fast-track status, detect viral RNA by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), which requires instrumentation, trained users, and considerable sample preparation. Thus, they must be sent to &#34;approved&#34; reference laboratories, requiring time. Indeed, in August 2016, the Center for Disease Control (CDC) was asking pregnant women who had been bitten by a mosquito and developed a Zika-indicating rash to wait an unacceptable 2 to 4 weeks before learning whether they were infected. We very much need tests that can be done on site, with few resources, and by trained but not necessarily licensed personnel.
This video demonstrates an assay that meets these specifications, working with urine or serum (for patients) or crushed mosquito carcasses (for environmental surveillance), all without much sample preparation. Mosquito carcasses are captured on paper carrying quaternary ammonium groups (Q-paper) followed by ammonia treatment to manage biohazards. These are then directly, without RNA isolation, put into assay tubes containing freeze-dried reagents that need no chain of refrigeration. A modified form of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification with target-specific fluorescently tagged displaceable probes produces readout, in 30 min, as a three-color fluorescence signal. This is visualized with a handheld, battery-powered device with an orange filter. Forward contamination is prevented with sealed tubes, and the use of thermolabile uracil DNA glycosylase (UDG) in the presence of dUTP in the amplification mixture.

Current multiplexed diagnostics to detect Zika, chikungunya, and dengue viruses require complex sample preparation and expensive instrumentation, and are difficult to use in low resource environments. We show a diagnostic that uses isothermal amplification with target-specific strand displaceable probes to detect and differentiate these viruses with high sensitivity and specificity.

Çoğaltılmış izotermal amplifikasyon Zika, Chikungunya ve dang 1 tespit etmek için teşhis platformu dayalı

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

Biyokimya

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method requires a more technically demanding operation and involves complicated procedures, especially when used in larvae due to their small size, relatively thin and fragile cuticle, and high mortality, which limit its application. In contrast, viral vectors for gene delivery have been developed to surmount extracellular and intracellular barriers. These systems have the advantages of easy manipulation, high gene transduction efficiency, long-term maintenance of gene expression, and the ability to produce persistent effects in vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) are mosquito-specific, small single-stranded DNA viruses that can effectively deliver foreign nucleic acids into mosquito cells; however, the replacement or insertion of foreign genes to create recombinant viruses typically causes a loss of packaging and/or replication abilities, which is a barrier to the development of these viruses as delivery vectors.
Herein, we report using an artificial intronic small-RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. Detailed procedures for the construction, packaging and quantitative analysis of the rAaeDV vectors, and for larval infection are described.
This study demonstrates, for the first time, the feasibility of developing a non-defective recombinant MDV micro RNA (miRNA) expression system, and thus providing a powerful tool for the functional analysis of genes in mosquito and establishing a basis for the application of viral paratransgenesis for controlling mosquito-borne diseases. We demonstrated that Aedes albopictus 1st instar larvae could be easily and effectively infected by introducing the virus into the water body of the larvae breeding site and that the developed rAaeDVs could be used to overexpress or knock down the expression of a specific target gene in larvae, providing a tool for the functional analysis of mosquito genes.

We report using an artificial intronic small RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. A detailed procedure for the construction, packaging, and quantitative analysis of the rAaeDV vectors as well as for larval infection is described.

Sivrisinek larva genlerin fonksiyonel analiz için bir gen teslim vektör olarak rekombinant sivrisinek Densovirus kullanın

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

Gelişim Biyolojisi

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting chromosomal rearrangements, and studying three-dimensional (3D) organization of chromosomes in the cell nucleus. The advent of laser capture microdissection (LCM) and whole genome amplification (WGA) allows obtaining large quantities of DNA from single cells. The increased sensitivity of WGA kits prompted us to develop chromosome paints and to use them for exploring chromosome organization and evolution in non-model organisms. Here, we present a simple method for isolating and amplifying the euchromatic segments of single polytene chromosome arms from ovarian nurse cells of the African malaria mosquito Anopheles gambiae. This procedure provides an efficient platform for obtaining chromosome paints, while reducing the overall risk of introducing foreign DNA to the sample. The use of WGA allows for several rounds of re-amplification, resulting in high quantities of DNA that can be utilized for multiple experiments, including 2D and 3D FISH. We demonstrated that the developed chromosome paints can be successfully used to establish the correspondence between euchromatic portions of polytene and mitotic chromosome arms in An. gambiae. Overall, the union of LCM and single-chromosome WGA provides an efficient tool for creating significant amounts of target DNA for future cytogenetic and genomic studies.

Chromosome painting is a useful method for studying organization of the cell nucleus and evolution of the karyotype. Here, we demonstrate an approach to isolate and amplify specific regions of interest from single polytene chromosomes that are subsequently used for two- and three-dimensional fluorescent in situ hybridization (FISH).

Sıtma Sivrisineklerinde 2D ve 3D Kromozom Boyama

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Araçlar Viral Immunomodulators ve ana bilgisayar Antiviral faktörler tanımlanması için eleme olarak Abdovirüs enfeksiyonlar

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Zika Virüsü Kullanan Aedes aegypti Sivrisineklerinde Vektör Yetkinlik Analizleri

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

Yetişkin Sivrisineklerde Oral Beslenme ve Mikroenjeksiyon ile Deneysel Viral Enfeksiyon

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Biyoloji

Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that enable sensitive and simultaneous labeling of viral nucleic acid and protein. Conventional DNA fluorescence in situ hybridization (FISH) methods are often not compatible with immunostaining. We have therefore developed an imaging approach, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA and protein), which enables simultaneous single-cell visualization of DNA, RNA, and protein. Compared to conventional DNA FISH, MICDDRP utilizes branched DNA (bDNA) ISH technology, which dramatically improves oligonucleotide probe sensitivity and detection. Small modifications of MICDDRP enable imaging of viral proteins concomitantly with nucleic acids (RNA or DNA) of different strandedness. We have applied these protocols to study the life cycles of multiple viral pathogens, including human immunodeficiency virus (HIV)-1, human T-lymphotropic virus (HTLV)-1, hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), Zika virus (ZKV), and influenza A virus (IAV). We demonstrated that we can efficiently label viral nucleic acids and proteins across a diverse range of viruses. These studies can provide us with improved mechanistic understanding of multiple viral systems, and in addition, serve as a template for application of multiplexed fluorescence imaging of DNA, RNA, and protein across a broad spectrum of cellular systems.

Presented here is a protocol for a fluorescence imaging approach, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), a method capable of simultaneous fluorescence single-cell visualization of viral protein and nucleic acids of different type and strandedness. This approach can be applied to a diverse range of systems.

Viral Nükleik Asitleri ve Proteinleri Görselleştirmek ve HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virüsü ve İnfluenza Enfeksiyonunu İzlemek için Tek Hücreli Çoklanmış Floresan Görüntüleme

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that ...