Vasiliki Chantzara zamanlı matings ve fare yetiştiriciliği için Oftalmoloji UCL Enstitüsü biyolojik kaynak birimi personeli dışarı taşımak için teşekkür ediyoruz. Bu çalışmada Wellcome güven Araştırmacı Ödülü 095623/Z/11/Z CR tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan çalışma İngiltere'de İçişleri Bakanlığı ve yerel etik kurallarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Özet adımları ve zamanlama
<ol><li>Zamanlanmış matings yetişkin farelerin embriyonik gün (e) 9,5-e13.5 gebelik elde etmek için soruşturma altında biyolojik soruyu cevaplamak uygun bir yük gerçekleştirmek; 12-15 gün gerektirir.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) hazırlamak / 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) çözüm ve enjeksiyon (iletişim kuralı Bölüm 2); gerektirir ~ 1 h bir gün önce veya EdU/BrdU etiketleme istenilen uzunluğa göre embriyo yalıtım günü.</li>
	<li>Gerçekleştirmek embriyo yalıtım ve arka beyin diseksiyon (iletişim kuralı Bölüm 3); gerektirir ~ 10 dk/embriyo.</li>
	<li>(İletişim kuralı Bölüm 4) etiketleme wholemount ayirt gerçekleştirmek; 3 gün gerektirir.</li>
	<li>Bir vibratome kullanarak bölüm ve kayan bölüm ayirt (iletişim kuralı Bölüm 4) etiketleme gerçekleştirmek: 2 gün gerektirir.</li>
	<li>Bir cryostat kullanarak bölüm ve ayirt cryosections (iletişim kuralı Bölüm 5); etiketleme gerçekleştirmek 2 gün gerektirir.</li>
</ol>2. enjekte hamile kadın fare BrdU veya EdU (isteğe bağlı)
<ol><li>BrdU veya EdU steril fosfat tamponlu tuz (PBS) konsantrasyonları 10 mg/mL ve 1 mg/mL, içinde sırasıyla geçiyoruz. Dikkat: BrdU ve EdU are zehirli; uygun koruma giymek.</li>
	<li>Hamile fare tartmak ve 100 mg/kg BrdU ulaşmak için yönetilen BrdU veya EdU çözüm hacmi hesaplamak veya 5 mg/kg EdU.</li>
	<li>Mayi rota üzerinden BrdU veya EdU çözüm embriyolar etiketleme gerekli uzunluğu bağlı olarak toplama önce her iki 1 s veya 1 gün enjekte. Not: 1 h için etiketleme S fazlı arka beyin hücreleri görüntüler. 1 gün için etiketleme arka beyin NPCs döl görüntüler.</li>
</ol>3. Hindbrains e9.5 - e13.5 fare embriyo gelen diseksiyon
<ol><li>Zaman aşımına uğradı-hamile bir kadın fare gerekli gebelik aşamasında (örneğin, servikal çıkığı) etik onaylanmış bir yordam kullanarak ötenazi. Keskin makas kullanırken, Periton boşluğuna ikiye ayıracağım ve dikkatli bir şekilde rahim tüketim. Embriyo bir 60 mm plastik tabak içine 20 mL buz gibi PBS içeren içeren eksize rahim yerleştirin. Not: Aseptik teknik gerekli değildir.</li>
	<li>Tüm daha fazla diseksiyon diseksiyon mikroskop kullanarak gerçekleştirin. Saatçi forseps sayı 5 kullanarak, embriyoların ortaya çıkarmak, göbek kordonu kesilmesinin tarafından her embriyo bırakın ve sarısı sac kaldırmak için rahim kas duvar gözyaşı.</li>
	<li>Steril bir Pasteur pipet wide-sıkıcı açılış ile kullanarak, buz gibi PBS ile temiz plastik bir çanak içine her embriyo transfer.</li>
	<li>Saatçi forseps sayı 55 kullanarak, kafa (şekil 1E) sever.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, küçük bir parça genomik DNA izolasyon ve sonraki Genotipleme için (örneğin, bir yumurta sarısı sac veya yaklaşık 2 mm kuyruk ucu ¼) doku korumak.</li>
	<li>Saatçi forseps sayı 55 kullanarak, paralel ve hemen altında yüz ve ön dokudan (şekil 1F) ayırmak için arka beyin neuroepithelium arka beyin içeren doku tüketim.</li>
	<li>Kaudal baş doku dorsal yan ve arka beyin yukarı getirin ve bir ince bir doku tabakası (çatı plaka) kaplı 4th ventrikül tanımlamak. Dikkatle saatçi forseps sayı 55 (şekil 1G) kullanarak çatı plaka işlemek ve forseps, rostrally orta çizgi orta üzerinde hareket ile dış görev aşırı doku soyma ve arka arka beyin ve spinal kord (şekil 1G bitti caudally ); Arka beyin şimdi bir açık kitap hazırlık (şekil 1 H) maruz.</li>
	<li>Hindbrains wholemount immunolabeling (seçenek 1) için hazır olun.<ol>
<li>Saatçi forseps sayı 55 kullanarak, dikkatli bir şekilde uzak kalan baş Mezenşim ve forseps (şekil 1I) kullanarak arka beyin pial tarafına bağlı herhangi bir meninkslerde tease. Orta ve spinal kord doku (şekil 1J) sadece arka beyin doku (şekil 1 K) bırakmak çıkarın. Not: girişimde büyük olasılıkla arka beyin neuroepithelium zedeleyecek çünkü bu adım yordam e9.5 veya e10.5, izlenmesi gereken değil; Arka beyin neuroepithelium immunolabeling antikor verimli nüfuz izin vermek için bu aşamada yeterince ince olduğundan Ayrıca, meninkslerde kaldırma gerekli değildir. Bu adım gerekir, ancak, meninjeal doku birleştirir, antikor penetrasyon arka beyin neuroepithelium içine geliştirmek için zaman ileriye doğru e11.5 takip edilebilir. Diseksiyon buz gibi PBS (kullanım temiz PBS için her arka beyin) gerçekleştirildiğinde en kolay yoldur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vibratome ve cryosectioning (seçenek 2) için hindbrains hazırlamak<ol>
<li>Saatçi forseps sayı 55 kullanarak, orta ve spinal kord doku (şekil 1J) kaldırın. Not: Mezenşim ve hindbrains ( şekil 1Iiçinde gösterildiği gibi) kesit için amaçlanan meninkslerde kaldırmak için gerekli değildir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hindbrains plastik tabak Pasteur pipet kullanarak yuvarlak popolu 2 mL tüpler için transfer tüm PBS Aspire edin ve saptamak için nazik-ajitasyon olarak PBS içinde çözünmüş taze çözdürülen % 4 w/v formaldehit ile 4 ° C'de 2 h. Uyarı: Toksik formaldehit; uygun koruma giymek.</li>
	<li>Hindbrains 3 x kez PBS ile yıkayın. İmmunolabeling 2-3 gün içinde başlar veya % 100 metanol-20° c de daha uzun depolama için aktarmadan önce % 50 methanol/50% PBS 5 min için PBS yerine PBS 4 ° C'de depolayın
</li>
</ol>4. Wholemount ayirt
<ol><li>Gerekirse, seri olarak, oda sıcaklığında (RT) 5 min için PBS (örneğin, % 75 metanol, % 50 metanol, % 25 metanol) olarak metanol dilutions azaltma içinde hindbrains suyla temasa ve sonra PBS için transfer. Not: Metanol kademeli bir dizi yavaşça hindbrains suyla temasa ve uygun doku koruma sağlamak için gereklidir.</li>
	<li>Hindbrains % 0.1 içeren PBS 4 ° C'de 30 dk permeabilize nazik ajitasyon ile Triton X-100 (PBT).</li>
	<li>Hindbrains % 10 ısı inaktive keçi serum nazik ajitasyon ile içeren PBT 4 ° C'de 1 h için kuluçkaya. Not: ikincil antikor olarak yetiştirildik ana bilgisayar türlerden serum kullanın. Birincil antikorlar keçi, yükseltilmiş kuluçkaya için serum-serbest protein blok, örneğin % 5 sığır serum albümin PBS veya uygun bir ticari alternatif ( Tablo malzemelerigörmek). Bu non-spesifik birincil antikorlar keçi kaldırdı kullanırken sık sık gözlenen boyama azaltacaktır.</li>
	<li>Hindbrains gecede 4 ° C'de % 1 ısı inaktive serum ve nazik ajitasyon ile birincil antikorlar içeren PBT içinde kuluçkaya (örneğin, tavşan anti-fosfo Histon H3 [pHH3] 1: 400 seyreltilmiş). Not: keçi kaldırdı birincil antikorlar için serum PBT kullanın.</li>
	<li>Hindbrains 4 ° C'de 5 yıkama PBT ile x 1 h için.</li>
	<li>Hindbrains gecede 4 ° C'de uygun fluorophore Birleşik ikincil antikorlar (örneğin, keçiyi Anti-tavşan Alexa Fluor 488), 1: 200 kullanılan birincil antikorlar karşı hedeflenen PBT içinde içeren PBT içinde kuluçkaya. Karanlıkta hindbrains buradan photobleaching fluorophores korumaya devam et. Not: keçi kaldırdı birincil antikorlar için non-spesifik boyama azaltmak için ikincil antikorlar Anti-keçi Fab parçaları kullanın.</li>
	<li>Hindbrains 4 ° C'de 5 yıkama PBT ile x 1 h için.</li>
	<li>PBS içinde % 4 formaldehit antikor bağlama uzun vadeli korunması için RT, 15 dakika içinde hindbrains sonek. Kısa bir süre içinde iki kez PBS durulayın.</li>
	<li>Bir cam mikroskop kaymak siyah Elektrik bandı iki kat ile kapak ve küçük bir kare bir arka beyin alacak kadar büyük bir cep oluşturmak için katmanlı kasetteki tüketim.</li>
	<li>Pasteur pipet ile bir cep içine her arka beyin transfer, aşırı sıvı kaldırın ve bunu yavaş yavaş kapsayan önce bindirme hava kabarcıkları coverslip altında önlemek için bir cam coverslip ile cep için uygun bir antifade reaktif ekleyin. Coverslip mühür ve ince bir tabaka halinde oje içeren yapıştırmayın. Slayt 4 ° C'de karanlık resim alma (iletişim kuralı Bölüm 7) kadar saklayın.</li>
</ol>5. Vibratome kesit ve bölüm ayirt kayan
<ol><li>Gerekirse, hindbrains metanol üzerinden 4.1 adımda anlatıldığı gibi suyla temasa.</li>
	<li>Hindbrains hazırlanan distile suda erimiş % 3 w/v özel katıştırın. Not: kısa bir süre için arka beyin ısı hasarı önlemek için gömme önce yaklaşık 55 ° C soğutmak erimiş özel izin.</li>
	<li>Enine arka beyin bölümleri bir vibratome kullanarak 70 µm kalınlık için kesti. Taze kesilmiş her bölüm bir boya fırçası ile buz gibi PBS içeren bir 24-şey plaka bir kuyunun içine aktarın.</li>
	<li>4.2-4.7, adımlarda açıklandığı gibi kayan bölümler etiket ama adımları aşağıdaki gibi değiştirin: yıkama kayan 4 ° C'de 15 dakika her biri, ikincil karşı antikorlar için 2 h kuluçka zamanı azaltmak ve RT., ikincil antikor kuluçkaya kadar PBT ile 3 x bölümleri</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, diğer epitopları için antikorlar ile 5.4 adımda anlatıldığı gibi etiketleme sonra EdU+ çekirdeği kiti üreticinin talimatlarına göre etiketleme bir EdU kullanarak bulmak. Karanlıkta 37 ° C'de 30 dk için kokteyl tepki kayan bölümlerde kuluçkaya. Yıkama arka beyin 4 ° C'de 15 dakika PBT ile 3 x bölümleri.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, diğer epitopları için 5,4 adımda anlatıldığı gibi sonra etiketleme, BrdU+ çekirdeği aşağıdaki gibi algılamak.<ol>
<li>Karanlıkta 30 dk 37 ° C'de 2 N hidroklorik asit kayan bölümlerde kuluçkaya.</li>
		<li>Yüzen iki kez 5 min için her RT, hidroklorik asit nötralize etmek için karanlıkta 0.1 M sodyum Borat tampon pH 8,5 bölümlerde kuluçkaya.</li>
		<li>Kayan bölümlerde 3 x kısaca PBS 4 ° C'de yıkama</li>
		<li>5.4. adımda açıklandığı gibi BrdU için etiketleme ayirt gerçekleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RT, 2 min 10 µg/mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) hücre çekirdeği counterstain için PBS için kayan bölümler kuluçkaya.</li>
	<li>%4 formaldehit RT., 15 dk için kayan bölümlerde postfix</li>
	<li>Kayan bölümlerde kısaca PBS yıkayın. Dikkatle kayan bölümler bir fırça kullanarak cam mikroskop kaymak aktarın. Bloting kağıt veya doku kullanarak bölümü çevresinde aşırı PBS kadar paspas.</li>
	<li>% 80 gliserol PBS ve kapak cam coverslip ile yavaş yavaş bindirme hava kabarcıklarını önlemek için kullanma bölümlerine bağlayın. Slayt 4 ° C'de karanlık resim alma (7. adım) kadar saklayın.</li>
</ol>6. cryostat kesit ve Cryosection ayirt etiketleme
<ol><li>Gerekirse, hindbrains metanol üzerinden 4.1 adımda anlatıldığı gibi suyla temasa.</li>
	<li>Hindbrains cryoprotect hindbrains önce dondurma için PBS içinde % 30 w/v Sükroz kuluçkaya. Not: Hindbrains onlar genellikle ≤ 2 h alır tüpü dibine battı zaman dondurma için hazır e9.5-10,5 hindbrains ve e11.5-13,5 hindbrains için 3-6 h için.</li>
	<li>Hindbrains optik kesim sıcaklık bileşik (OCT) daldırın ve hızlı bir şekilde hindbrains için kuru buz-50 ° C-40 ° C arasındaki soğutmalı isopentane Ekim içeren kalıplar aktararak dondurma. Not:-20 ° C kısa vadeli ve uzun vadeli kesit kadar-80 ° C dondurulmuş, katıştırılmış hindbrains saklanır.</li>
	<li>Enine arka beyin bölümleri bir cryostat ve transfer Elektrostatik yapışkanlı mikroskop slaytlara kullanarak 10 µm kalınlığında kesilmiş. Not: Arka beyin cryosections-20 ° C kısa vadeli ve uzun vadeli etiketleme kadar-80 ° C saklanır.</li>
	<li>Slaytları slaytlar bölümlerine kuru RT 15 dakika, kuluçkaya. Cryosections PBS ile yıkayın erime OCT ve mark hidrofobik bir engel etrafında bir PAP kalemi cryosections. 5.4-5,8 adımları yineleyin.</li>
	<li>5.10 polivinil alkol bazlı montaj orta gliserol yerine kullanarak adımları yineleyin.</li>
</ol>7. resim alma
<ol><li>Bir epifluorescent veya confocal lazer tarama mikroskop lâyık Sulu ortam takılı slaytlar ve optik filtreler immunolabeling için kullanılan fluorophores için uygun lensler ile donatılmış kullanarak resim örnekleri.</li>
	<li>Bütün arka beyin veya bir arka beyin bölümü görüntü için bir lens kullanmak için 10 x büyütme (örneğin, şekil 2B); miktar için hindbrains alanları görmek için bir 40 X büyütme (örneğin, şekil 2B) ve tek tek hücreler görselleştirmek, (örneğin, resim 2C) 63 x büyütme ile bir lens kullanmak için kullanın.</li>
</ol>8. alternatif yöntemler
<ol><li>Adım 3.8, bir tek hücre süspansiyon Akış Sitometresi uygulamaları15için üretmek için sabitlenmemiş hindbrains homojenize.</li>
	<li>Adım 3.8 RNA tek hücre süspansiyonlar RT-qPCR için (örneğin, 16) ayıklamak için sabitlenmemiş hindbrains homojenize. Not: steril ve RNase içermeyen boyunca RNA'ın yıkımı önlemek için tüm reaktifler ve ekipman tutulur emin olun.</li>
	<li>Adım 3.8, NPCs yalıtmak ve onları vitro olarak neurospheres arka beyin NPC davranış17çözümlenmesi için yaymak için sabitlenmemiş hindbrains homojenize. Not: tüm reaktifler ve ekipman neurosphere kültürlerin bakteriyel/mantar kontaminasyonu önlemek için steril tutulur emin olun.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wilsch-Brauninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortex+expansion+in+development+and+evolution+-+from+cell+biology+to+single+genes.">Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes.</a> Curr Opin Neurobiol. 39, 122-132 (2016).</li><li>Gregg, C., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNTF/LIF/gp130+receptor+complex+signaling+maintains+a+VZ+precursor+differentiation+gradient+in+the+developing+ventral+forebrain.">CNTF/LIF/gp130 receptor complex signaling maintains a VZ precursor differentiation gradient in the developing ventral forebrain.</a> Development. 132 (3), 565-578 (2005).</li><li>Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eomes::GFP-a+tool+for+live+imaging+cells+of+the+trophoblast,+primitive+streak,+and+telencephalon+in+the+mouse+embryo.">Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo.</a> Genesis. 45 (4), 208-217 (2007).</li><li>Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hox+Genes+and+the+Hindbrain:+A+Study+in+Segments.">Hox Genes and the Hindbrain: A Study in Segments.</a> Curr Top Dev Biol. 116, 581-596 (2016).</li><li>Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+axon+guidance+of+cranial+motor+neurons.">Patterning and axon guidance of cranial motor neurons.</a> Nat Rev Neurosci. 8 (11), 859-871 (2007).</li><li>Fantin, A., Vieira, J. M., Plein, A., Maden, C. H., Ruhrberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+mouse+hindbrain+as+a+qualitative+and+quantitative+model+for+studying+the+molecular+and+cellular+mechanisms+of+angiogenesis.">The embryonic mouse hindbrain as a qualitative and quantitative model for studying the molecular and cellular mechanisms of angiogenesis.</a> Nat Protoc. 8 (2), 418-429 (2013).</li><li>Terriente, J., Gerety, S. S., Watanabe-Asaka, T., Gonzalez-Quevedo, R., Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+from+hindbrain+boundaries+regulates+neuronal+clustering+that+patterns+neurogenesis.">Signalling from hindbrain boundaries regulates neuronal clustering that patterns neurogenesis.</a> Development. 139 (16), 2978-2987 (2012).</li><li>Coolen, M., Thieffry, D., Drivenes, O., Becker, T. S., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-9+controls+the+timing+of+neurogenesis+through+the+direct+inhibition+of+antagonistic+factors.">miR-9 controls the timing of neurogenesis through the direct inhibition of antagonistic factors.</a> Dev Cell. 22 (5), 1052-1064 (2012).</li><li>Dias, J. M., Alekseenko, Z., Applequist, J. M., Ericson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tgfbeta+signaling+regulates+temporal+neurogenesis+and+potency+of+neural+stem+cells+in+the+CNS.">Tgfbeta signaling regulates temporal neurogenesis and potency of neural stem cells in the CNS.</a> Neuron. 84 (5), 927-939 (2014).</li><li>Jacob, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid+acid+specifies+neuronal+identity+through+graded+expression+of+Ascl1.">Retinoid acid specifies neuronal identity through graded expression of Ascl1.</a> Curr Biol. 23 (5), 412-418 (2013).</li><li>Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derive+from+the+more+apical+daughter+in+asymmetric+divisions+in+the+zebrafish+neural+tube.">Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube.</a> Nat Neurosci. 13 (6), 673-679 (2010).</li><li>Peretz, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+role+of+hindbrain+boundaries+as+pools+of+neural+stem/progenitor+cells+regulated+by+Sox2.">A new role of hindbrain boundaries as pools of neural stem/progenitor cells regulated by Sox2.</a> BMC Biol. 14, 57 (2016).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by+confocal+microscopy.">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy.</a> J Vis Exp. (26), (2009).</li><li>Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+manipulate+the+fate+of+single+neural+stem+cells+in+tissue.">A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue.</a> Nat Neurosci. 15 (2), 329-337 (2011).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li><li>Hutton, S. R., Pevny, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+expression+levels+distinguish+between+neural+progenitor+populations+of+the+developing+dorsal+telencephalon.">SOX2 expression levels distinguish between neural progenitor populations of the developing dorsal telencephalon.</a> Dev Biol. 352 (1), 40-47 (2011).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+embryonic+mouse+neural+stem+cell+culture+using+the+neurosphere+assay.">Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li><li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+the+neural+tube.">Mitosis in the neural tube.</a> The Journal of Comparative Neurology. 62 (2), 377-405 (1935).</li><li>Sessa, A., Mao, C. A., Hadjantonakis, A. K., Klein, W. H., Broccoli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbr2+directs+conversion+of+radial+glia+into+basal+precursors+and+guides+neuronal+amplification+by+indirect+neurogenesis+in+the+developing+neocortex.">Tbr2 directs conversion of radial glia into basal precursors and guides neuronal amplification by indirect neurogenesis in the developing neocortex.</a> Neuron. 60 (1), 56-69 (2008).</li><li>Pilz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+progenitors+in+the+mammalian+telencephalon+includes+a+new+radial+glial+cell+type.">Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type.</a> Nat Commun. 4, 2125 (2013).</li><li>Fantin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+macrophages+act+as+cellular+chaperones+for+vascular+anastomosis+downstream+of+VEGF-mediated+endothelial+tip+cell+induction.">Tissue macrophages act as cellular chaperones for vascular anastomosis downstream of VEGF-mediated endothelial tip cell induction.</a> Blood. 116 (5), 829-840 (2010).</li><li>Kayam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Pax6+in+the+segmental+organization+of+the+hindbrain.">A novel role for Pax6 in the segmental organization of the hindbrain.</a> Development. 140 (10), 2190-2202 (2013).</li><li>Tata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+embryonic+neurogenesis+by+germinal+zone+vasculature.">Regulation of embryonic neurogenesis by germinal zone vasculature.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), 13414-13419 (2016).</li></ol>

Yazarlar rakip çıkarları ya da çakışan ilgi alanları yok.

Bu iletişim kuralı, gelişimsel neurogenesis mekanizmaları incelemek için bir model olarak fare embriyonik arka beyin kullanmayı açıklamaktadır. Farklı immunolabeling yöntemler kullanarak, arka beyin NPCs görüntülenmeyecektir ve doku bölümleri veya organ wholemounts genelinde sayıları sayılabilir. Arka beyin organ çapında neurogenesis kalıpları üzerinde bilgi toplamak için bir 'açık kitap' hazırlık görüntüsü diseksiyon ve düz anatomi kolaylığı sağlar.
Biz daha fazla NPC morfoloji ve hücre döngüsü ile ilgili NPC konumlandırma kolayca içinde yüzen görüntülenmeyecektir olduğunu gösterir-ya da arka beyin cryosections. Her iki davranış daha önce memeli telencephalon20dakika sonra gerçekleştirilen gibi yeni yaratıcı nüfus, tanımlamak için istismar. Örneğin, erken oluşan Sox2+ neuroepithelia ve Pax6+ apikal Radyal glia arka beyin21,22' var, ancak arka beyin Tbr2+ Bazal ataları3 eksik .
Burada açıklanan protokolü de floresan canlı görüntüleme ve/veya sabit dokularda soy izleme için etiketleme tarafından özel NPC altgrupları davranışlarını gözlemlemek için adapte edilebilir. Bu, örneğin, hindbrains üzerinden tamoxifen indüklenebilir Sox1-iCreERT2 transgene ve Rosa26tdTomato muhabir23taşıyan fareler inceleyerek elde edilebilir.
Arka beyin daha fazla benzer olması beklenen son derece korunmuş beyin bölgesi olduğu için fare neurogenesis bilgisine artırmanın yanı sıra, arka beyin eğitim türler arasında paylaşılır geniş ilgili Nörojenik mekanizmaları aydınlatmak ön daha omurgalı türler arasında.
Arka beyin neurogenesis ön neurogenesis23daha nispeten daha kısa bir zaman penceresi üzerinden gerçekleşir gibi yeterince karşılaştırmak için ihtiyaç embriyo sahnelenen dikkate almak önemlidir. Buna göre deneysel önyargı sayma ve onun arka beyin izole önce bir embriyo somite çiftlerinin sayısı kayıt tarafından önlenmiş olur. Arka beyin doku kırılgandır ve forseps bu nedenle dikkatli bir şekilde baş Mezenşim ve meninkslerde arka beyin doku ayıran zaman ele alınmalıdır; değerli embriyo diseksiyon çalıştı önce 'uygulama çalışan' bir çift bu nedenle tavsiye olabilir. Ayrıca, hindbrains bir tüp sizden bir geniş-geçişli Pasteur pipet kullanarak başka bir yerine (pipet'ın açılış genişlemiş ucu kesme tarafından temiz makasla) zarar görmemesi için Forseps ile aktarılmalıdır. Son olarak, her ne kadar nadir, S-faz NPCs içine EdU/BrdU şirketleşme ölçüde değişken, özellikle kısa (Yani, 1 h) darbeleri sırasında olabilir. Etiketleme artırmak için çözüm şırınga yüklemeden önce EdU/BrdU düzgün çözünmüş emin olun ve dikkatle Periton boşluğuna enjekte. Bu subkutan kaza ile yaptığı gibi zavallı enjeksiyonları kaybetme veya EdU/BrdU çözüm bindirme neden ve dolaşımı girmesini önlemek.

Embriyonik memeli geliştirme sırasında ventrikül (VZ) ve subventricular (SVZ) bölgeleri genişleyen neuroepithelium 'neurogenesis' olarak adlandırılan bir süreç içinde yeni sinir hücreleri oluşturmak için NPCs bölün. Daha az diğer bölgelerde bu işlem hakkında bilinen iken üretimi kendi NPC öncüleri ve yeni nöronlar ön1' de, kapsamlı soruşturma.
Ön anlama neurogenesis desenler arasında tüm organ zorlu yapan histolojik yöntemlerle doku kesit sonra büyük ölçüde okudu bir karmaşık ve girift katlanmış yapısıdır. Ayrıca, ön neurogenesis çalışmaların diğer beyin bölgeleri veya spinal kord Nörojenik davranışının mutlaka akıllı değildir. Örneğin, farklı CNS bölgeler arasında farklı yanıt Temin ipuçlarını gibi silier Nörotrofik faktör ve lösemi inhibitör faktörü söz konusu olduğunda sinyal, hangi kendini-NPCs yenilenmesi yanal ganglionic Hazretleri, ancak sürücü teşvik spinal kord ataları2farklılaşma. Ayrıca, gelişmekte olan ön doldurmak ve serebral korteks1 genişlemesi için önemli ölçüde katkıda NPCs bir alt sınıfı yok arka beyin ve omurilik3. Ters, spinal kord ve arka beyin korteks yok alternatif NPC alt türlerini içeren akla yatkın.
Fare embriyo arka beyin memeli beynin evrimsel en eski bölgesi ve serebellum ve beyin sapı oluşturur. Türler arasında onun koruma rağmen nispeten az NPC alt türlerinden veya kendi mevzuatı da dahil olmak üzere arka beyin neurogenesis hakkında bilinir. Arka beyin araştırma fare çoğunluğu doku segmentasyon, Hox genleri4ve sonrası Mitotik nöronlar5desenlendirme tarafından tahrik işlem üzerinde odaklanmıştır. Buna ek olarak, arka beyin bir model olarak gelişimsel angiogenez6mekanizmaları eğitim için kullanılmıştır.
Fare arka beyin aksine, Zebra balığı arka beyin yoğun NPC farklılaşma ve omurgalı model organizma (örneğin,7,8) ilerlemesinde soy takip etmek kullanılmıştır. Piliç arka beyin aynı zamanda omurgalı geliştirme sırasında (örneğin,9,10) neurogenesis çalışmaya istihdam edilmiştir. Zebra balığı arka beyin11benzer, piliç arka beyin NPC davranış ve yönetmelik saat12üzerinde çalışmaya görüntülü canlı olabilir. Çünkü onlar geliştirmek yanında canlı düşsel benzer boyuna gözlem memeli canlılar arasında şu anda mümkün değildir rahimde. Ayrıca, manipülasyon teknikleri ile elektroporasyon kolayca evrimleşmiş Zebra balığı embriyo veya civciv embriyo ovo içinde (örneğin,13) için uygulanabilir, ama böyle teknikleri de daha içinde zor gibi hedef Rahim.
Yine de, fare embriyo arka beyin zarif neurogenesis yöneten moleküler ve hücresel mekanizmaları tanımlamak için uygundur. İlk olarak, fare arka beyin analizini birçok durumda daha insanlar gelişmeler için bundan daha düşük omurgalılar eğitim yoluyla elde edilen ilgili bilgi sağlar. Ayrıca, çok sayıda genetiği değiştirilmiş fare suşları kullanılabilir ya kader fare NPCs eşleme için veya düzenleyici mekanizmaları ile ilgili genlerin kurucu veya koşullu mutant gen değiştirmek için kullanılabilir. Son olarak, bu son zamanlarda o mikroenjeksiyon gösterilmiştir ventrikül arka beyin ataları ex vivo arka beyin NPC Kinetik14kısa en az bir inceleme sağlar. Henüz, şu anda çok az arka beyin NPCs bütün organ bağlamda davranışını ve kronolojik zamanmekansal organizasyon hakkında bilinir.
Burada, biz arka beyin wholemount hazırlıkları ve doku bölümleri memeli NPC davranışını analiz etmek için güçlü bir model olarak kullanmak için basit ve hızlı bir yöntem göstermek. Daha fazla immunolabeling farklı neurogenesis parametreleri eğitim süreci arka beyin örnekleri daha fazla nicel transkriptaz (qRT) gibi aşağı akım moleküler uygulamalar için kullanılacak iletişim kurallarını sağlamak-PCR.

<table><tbody><tr><td>Round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock)</td><td>VWR</td><td>211-2120</td><td>Also available from other commercial suppliers</td></tr><tr><td>Plastic cell culture dish, 60 mm</td><td>Thermo Fisher</td><td>150288</td><td>Also available from other commercial suppliers</td></tr><tr><td>Cell culture plates, 12-well</td><td>Thermo Fisher</td><td>150628</td><td>Also available from other commercial suppliers</td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>Copan</td><td>200C</td><td>Also available from other commercial suppliers</td></tr><tr><td>Dumont Watchmaker forceps, no. 5</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Watchmaker forceps, no. 55</td><td>FST</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>29G needle/syringe</td><td>BD</td><td>BD Micro-Fine +1ml</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-histone H3 primary antibody</td><td>Millipore</td><td>06-570</td><td>Goat, dilution 1:400</td></tr><tr><td>Anti-BrdU primary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>Rat, dilution 1:400</td></tr><tr><td>Anti-Ki67 primary antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>550609</td><td>Mouse, dilution 1:400</td></tr><tr><td>Anti-RC2 primary antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>RC2</td><td>Mouse (IgM), dilution 1:400</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit secondary antibody</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11029</td><td>Dilution 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary antibody</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11037</td><td>Dilution 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM secondary antibody</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21042</td><td>Dilution 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td>Dilution 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat secondary antibody</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11007</td><td>Dilution 1:200</td></tr><tr><td>4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Use at 10 &amp;mu;g per mL</td></tr><tr><td>5-ethynyl-2&amp;rsquo;-deoxyuridine (EdU)</td><td>Sigma</td><td>900584</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-2&amp;acute;-deoxyuridine (BrdU)</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>C10086</td><td></td></tr><tr><td>Heat-inactivated goat serum</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>DAKO protein-block serum free</td><td>Agilent</td><td>X0909</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Also available from other commercial suppliers</td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td>Also available from other commercial suppliers</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Also available from other commercial suppliers</td></tr><tr><td>Sodium tetraborate</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td>Also available from other commercial suppliers</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>Also available from other commercial suppliers</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>Also available from other commercial suppliers</td></tr><tr><td>Super PAP pen liquid blocker</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>22309</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Antifade Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>S-2828</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>10337700</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Millipore</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Scigen</td><td>4583</td><td>Also available from other commercial suppliers</td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td>Also available from other commercial suppliers</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>10675112</td><td>Also available from other commercial suppliers</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Thermo Fisher</td><td>10316380</td><td>Also available from other commercial suppliers</td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>VWR</td><td>631-0912</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost microscope slides</td><td>VWR</td><td>631-0108</td><td></td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>VWR</td><td>620-0858</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>VWR</td><td>631-0137</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Microscope, Leica MZ16</td><td>Leica</td><td>not applicable</td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope&amp;nbsp; LSM710</td><td>Zeiss</td><td>not applicable</td><td></td></tr></tbody></table>

the mouse hindbrain as a model for studying embryonic neurogenesis

Fare embriyo ön memeli neurogenesis geliştirme sırasında çalışmak için en çok çalışan bir sistemdir. Ancak, son derece katlanmış ön neuroepithelium organ genelindeki neurogenesis modellerini incelemek için wholemount analiz için müsait değildir. Ayrıca, ön neurogenesis mekanizmaları tanımlama mutlaka neurogenesis beynin diğer bölümlerinde akıllı değildir; Örneğin, ön özgü progenitör alt türlerinden varlığı nedeniyle. Fare arka beyin wholemount analiz yanı sıra doku bölümler kronolojik zamanmekansal dağıtım ve sinirsel ataları davranışını gözlemlemek için mükellef embriyonik neurogenesis eğitim için alternatif bir model sağlar. Ayrıca, kolayca hücre izolasyon ya da moleküler biyoloji analiz gibi aşağı akım diğer uygulamalar için kesmiştim. Fare arka beyin kolayca çok sayıda hücre lineage muhabir ve kullanılabilir hale gelmiştir mutant fare suşları için analiz edilebilir gibi bir memeli gelişimsel neurogenesis hücresel ve moleküler mekanizmaları çalışmak için güçlü bir model sunuyor organizma. Burada, fare embriyo arka beyin wholemount hazırlıkları ve doku bölümleri memeli nöral progenitör hücre (NPC) davranışını analiz etmek için kullanmak için basit ve hızlı bir yöntem mevcut.

Bu bölümde wholemount ve doku bölüm analizi ile fare embriyonik arka beyin neurogenesis okurken elde edilebilir sonuçlar örnekleri gösterilmektedir.
Mitotik işaret pHH3 ( - 2B şekil D) VZ NPCs bölme görüntüler için microdissected arka beyin bir antikor ile o wholemount immunolabeling gösteriyoruz. Biz pHH3 göstermek+ NPCs mitoz (şekil 2C) farklı aşamalarında vurgulamak için bir yüksek büyütmede. Bu etiketleme yöntemi çeşitli ardışık gelişimin bu organ (şekil 2B) NPC mitoz zaman Elbette gözlemlemek için arka beyin arasında yapılması uygun olan resimli.
EdU enjeksiyon sonra enine immunolabeled vibratome bölümleri 1 h arka beyin görüntüleme Mitotik NPCs (3B rakam), Bisiklet pseudostratified, interkinetic nükleer geçiş desen bölünme yönünü görüntüler göster ataları18 (şekil 3B, D) ve genel VZ yapı (şekil 3B - D). O Mitotik pHH3 Not+ NPCs sadece ventrikül yüzeyde mevcut ve değil daha basally (şekil 3 c), hangi tezat ön19daha kararlı NPCs Bazal bölünme desen.
Biz de nasıl NPCs ve farklılaştırılmış onların döl Bisiklete binme BrdU EdU ile NPC lineage ilerleme (şekil 4) değerlendirmek için denetimin etiketi veya göstermektedir. Fare arka beyin 1 gün sonra BrdU enjeksiyon BrdU ve Ki67 enine cryosections immunolabelingsayı ve NPCs neuroepithelium (şekil 4A, B), mademki sayısını Bisiklete binme ve konumlandırma gösterir NPCs kendini sürekli yenileyen tanımlanabildiği Ki67 yüzdesi hesaplayarak+ BrdU+ hücreleri tüm BrdU+ hücreleri (4A rakam, C) arasında.
Son olarak, biz RC2, testin NPC endfeet (şekil 5B) ve süreçleri (şekil 5C) görselleştirmek için özel sinirsel ara filaman bir antijen immunolabeling arka beyin vibratome bölümlerin örneği gösterilmektedir. İnce cryosections, yerine Vibratome bölümleri gelişmiş gözlem çok dallı NPCs ve aynı zamanda genel neuroepithelial yapı sağlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig1.jpg"> Resim 1 : Anahtar adımlar bir arka beyin diseksiyon içinde e11.5 fare embriyonun. (A - D) Arka beyin mikrodiseksiyon şematik gösterimi. (A) Kaudal baş doku kırmızı noktalı çizgiler kesilmesinin tarafından kaldırılır. (B) çatı plaka deldi ve uzak (dikey kırmızı çizgiler) orta çizgi boyunca rostral ve Kaudal yönlerde yırtık ve daha sonra yanal arka beyin neuroepithelium ortaya çıkarmak için. (C) neuroepithelium her iki yapıları arasında forseps ekledikten sonra uzak meninkslerde oradayken ve orta ve omurilik doku kırmızı noktalı çizgiler boyunca Forseps ile doku kesilmesinin tarafından kaldırılır. (D) bu yordamı düzleştirilmiş bir arka beyin verir. (E-K) Görüntü yakalama arka beyin mikrodiseksiyon yordamdaki anahtar aşamaları. (E) embriyo noktalı çizgi kesilmesinin tarafından kafası. (F) arka beyin ve çatı plaka, içine 4th ventrikül varlığına ve noktalı çizgiler kesilmesinin tarafından başından ayrılmış. Çatı plaka (yıldız işareti) küçük bir delik delinmiş önce (G) 4th ventrikül yukarı doğru odaklı vardır. Delik doku dikkatle hem rostrally hem de caudally arka beyin ortaya çıkarmak için orta hat (oklar) peeling tarafından genişletilmiş. Konumlandırılmış pial yüzü aşağı ve dışarı bir açık kitap hazırlığı kapağı sol arka beyin olduğunu (H; siyah ok ucu arka beyin sinir dokusu gösterir). Arka beyin wholemount immunolabeling için gerekliyse, pial membran hafifçe arka beyin neuroepithelium forseps (Ben) kullanarak çevredeki meninjeal membranlar üzerinden gözetleyen tarafından kaldırılır. Fazla orta (mb) ve spinal kord (sc) doku olduğunu kaldırıldı (noktalı çizgiler içinde J) (K) arka beyin izole etmek. Ölçek çubuğu: 500 µm (E), (F - K) için 300 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig2.jpg"> Resim 2 : Wholemount immunolabeling-ebilmek var olmak kullanılmış-NPC mitoses arka beyin arasında ölçmek için. (A)şeması tr yüz görüntüleme arka beyin ventrikül katmanındaki Mitotik NPCs gösteren. V, ventrikül arka beyin yan; P, pial arka beyin yan. (B) Confocal kiremit tarama z destesini Mitotik işaret pHH3 (kırmızı) için wholemount immunolabeling takip e10.5 Arka beyin. Beyaz kutu daha yüksek büyütmede (D) ikinci panelinde gösterilen alanı gösterir. (C) ön anafaz (beyaz ok ucu) ve anafaz (siyah ok ucu) Mitotik figürler Mitotik NPCs. (D) saat ders wholemount pHH3 e9.5-13,5 etiketleme toplam kohort içinde ayırdedilebilir. Ölçek çubukları: 500 µm (B); 20 µm (C); 100 µm (D). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig3.jpg"> Şekil 3 : Rostral arka beyin onların germinal bölgesi içinde Bisiklete binme NPCs. Mitotik (yeşil) ve S-faz (kırmızı) NPCs arka beyin ventrikül yüzeyde ve periventriküler alanındaki konumunu sırasıyla tasvir eden(a)şeması. Arka beyin aracılığıyla sanal bir kesit daha yüksek büyütmede sağ tarafta görüntülenir. Siyah oku farklılaşma bölge doğru hücre döngüsü bölgeden çıkış yaptılar NPC döl geçiş yönünü belirtir. (B) Confocal z kayan e11.0 arka beyin bölümünden 1 h EdU nabız alınan bir embriyo yığını; immunolabeling pHH3 ve EdU Mitotik (yeşil) ve S-faz (kırmızı) NPCs, sırasıyla görselleştirmek için kullanıldı. Arka beyin yüzeyler noktalı çizgilerle gösterilir; V, ventrikül arka beyin yan; P, pial arka beyin yan. Beyaz kutu tarafından belirtilen alanı ilave olarak daha yüksek büyütmede görüntülenir; oklar, anafaz, ventrikül yüzeyine göre bir NPC bölünme boyutunda gösterir. (C) tek kanal pHH3 immunolabeling yalnızca görüntüleme. Mitotik NPCs tarafından mavi ok uçları gösterilir; Bazal bölünmeler eksikliği sadece EdU etiketleme görüntüleme Δ. (D) tek kanal tarafından belirtilir. EdU+ NPC pseudostratified dağıtım interkinetic onların nükleer geçiş nedeniyle evlat. Temsil edici bir turuncu çizgiyle belirtildiği şekilde NPCs uzak ventrikül yüzey göç mesafe ölçülebilir. Ölçek çubukları: 100 µm (B -D); 10 µm (B) iç metin içinde. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig4.jpg"> Şekil 4 : Arka beyin NPC kendini yenileme kapasitesini belirlemek için Ki67 etiketleme ile birleştirerek BrdU. (A)Confocal z etiketleme Ki67 (yeşil) ve 1 gün BrdU takip BrdU (kırmızı) darbe için sonra bir e10.5 Arka beyin cryosection yığını. Çift-pozitif ventrikül bölgedeki BrdU dahil olması ve hücre döngüsünün hala hareket NPCs Ki67 etiketleme tarafından belirtildiği şekilde hücrelerdir. Çift etiketli hücreleri arasında toplam BrdU+ nüfus oranının kendini yenileyerek NPCs. (B, C) yüzdesini gösterir tek kanal Ki67 görüntüleme (B) ve (C) BrdU immunolabeling sadece. Ki67 yoksun ve bu nedenle büyük olasılıkla hücre döngüsünün çıkıldığı BrdU+ hücrede mavi ok ucu (A,C) simgesiyle gösterilir. Arka beyin yüzeyler noktalı çizgilerle gösterilir; V, ventrikül arka beyin yan; P, pial arka beyin yan. Ölçek çubuğu: 50 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig5.jpg"> Şekil 5 : Testin immunolabeling görüntüler NPC süreçleri ve endfeet. (A - C) Ayirt bir epitope testin sinirsel ara filaman tanır, RC2 için NPC morfolojisi arasında arka beyin neuroepithelium gösterir. (A)Confocal z RC2 immunolabeling takip e11.5 Arka beyin kayan bir bölümünden yığını; Kutulu alanları içinde daha yüksek büyütmede gösterilir (B, B'; apikal/ventrikül bölge) ve (C, C'; Bazal Bölge). Arka beyin yüzeyler noktalı çizgilerle gösterilir; V, ventrikül arka beyin yan; P, pial arka beyin yan. (B, C) Confocal z yığınları kutulu yerlerde (A); Tek optik bölümleri içinde gösterilir (B', C'), anılan sıraya göre. Ventrikül yüzeyde demirlemiş bir NPC apikal endfoot (B') bir okla belirtilir. Tek ve fasciculated NPC süreçleri içinde siyah ve beyaz ok uçları belirttiği (C'), anılan sıraya göre. Ölçek çubukları: 100 µm, (A); 25 µm (B, C) için. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis at JoVE.com

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

Embriyonik Neurogenesis çalışmak için bir Model olarak fare arka beyin

Bu makalede nasıl fare embriyonik arka beyin bir model olarak tüm organ ve doku bölümü hazırlıklar gelişimsel neurogenesis eğitimi için kullanılabileceğini gösterir.

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

the-mouse-hindbrain-as-a-model-for-studying-embryonic-neurogenesis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.9K Görüntüleme.  UCL Institute of Ophthalmology. Bu makalede nasıl fare embriyonik arka beyin bir model olarak tüm organ ve doku bölümü hazırlıklar gelişimsel neurogenesis eğitimi için kullanılabileceğini gösterir.

Video: The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Embriyonik ventral orta beyin Organotipik Dilim Kültürler: dopaminerjik Nöronal Gelişim Eğitim Bir Sistem In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Nörobilim

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Civciv Embriyo aksonal Yörüngeler ve Synaptic Hedefler Trace için Beyin elektroporasyon

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult hippocampus has been viewed as a very static anatomical region of the mammalian brain. However, recent findings have demonstrated that the dentate gyrus of the hippocampus is an area of tremendous plasticity in adults, involving not only modifications of existing neuronal circuits, but also adult neurogenesis. This plasticity is regulated by complex transcriptional networks, in which the transcription factor NF-&#954;B plays a prominent role. To study and manipulate adult neurogenesis, a transgenic mouse model for forebrain-specific neuronal inhibition of NF-&#954;B activity can be used.
In this study, methods are described for the analysis of NF-&#954;B-dependent neurogenesis, including its structural aspects, neuronal apoptosis and progenitor proliferation, and cognitive significance, which was specifically assessed via a dentate gyrus (DG)-dependent behavioral test, the spatial pattern separation-Barnes maze (SPS-BM). The SPS-BM protocol could be simply adapted for use with other transgenic animal models designed to assess the influence of particular genes on adult hippocampal neurogenesis. Furthermore, SPS-BM could be used in other experimental settings aimed at investigating and manipulating DG-dependent learning, for example, using pharmacological agents.

Methods for the manipulation and analysis of NF-&#954;B-dependent adult hippocampal neurogenesis are described. A detailed protocol is presented for a dentate gyrus-dependent behavioral test (termed the spatial pattern separation-Barnes maze) for the investigation of cognitive outcome in mice. This technique should also help enable investigations in other experimental settings.

NF-KB-bağımlı yetişkin nöron Modülasyon ve Analiz Yöntemleri

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering the molecular signals that cooperatively guide neuronal migration in the embryonic brain is therefore important to understand how the complex neural networks form which later support postnatal life. Facial branchiomotor (FBM) neurons in the mouse embryo hindbrain migrate from rhombomere (r) 4 caudally to form the paired facial nuclei in the r6-derived region of the hindbrain. Here we provide a detailed protocol for wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains suitable to investigate the signaling pathways that regulate FBM migration. In this method, hindbrains of E11.5 mouse embryos are dissected and cultured in an open book preparation on cell culture inserts for 24 hr. During this time, FBM neurons migrate caudally towards r6 and can be exposed to function-blocking antibodies and small molecules in the culture media or heparin beads loaded with recombinant proteins to examine roles for signaling pathways implicated in guiding neuronal migration.

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the neural tube, but migrate to reach appropriate targets. Facial branchiomotor (FBM) neurons are a useful model to study neuronal migration. This protocol describes the wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains to investigate mechanisms that regulate FBM migration.

Fare Beyin<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kültür Yüz Branchiomotor Nöron Göç Eğitim için

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

Erken Postnatal fare beyin içine Interneuron öncüleri Homochronic nakli

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Enfeksiyon ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Embriyonik Fare Beyni Karışık Hücre Kültürleri

Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of neurons, astrocytes, oligodendrocytes, and microglia. Due to increasing efforts to replace and reduce animal use, a variety of in vitro cell culture systems have been developed to explore innate cell properties, which allow the development of therapeutics for CNS infections and pathologies. Whilst certain research questions can be addressed by human-based cell culture systems, such as (induced) pluripotent stem cells, working with human cells has its own limitations with regard to availability, costs, and ethics. Here, we describe a unique protocol for isolating and culturing cells from embryonic mouse brains. The resulting mixed neural cell cultures mimic several cell populations and interactions found in the brain in vivo. Compared to current equivalent methods, this protocol more closely mimics the characteristics of the brain and also garners more cells, thus allowing for more experimental conditions to be investigated from one pregnant mouse. Further, the protocol is relatively easy and highly reproducible. These cultures have been optimized for use at various scales, including 96-well based high throughput screens, 24-well microscopy analysis, and 6-well cultures for flow cytometry and reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) analysis. This culture method is a powerful tool to investigate infection and immunity within the context of some of the complexity of the CNS with the convenience of in vitro methods.

Yazar Spotlight: Enfeksiyon ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Embriyonik Fare Beyinlerinden Karışık Nöronal ve Glial Hücre Kültürlerinin Kurulması  

This protocol presents a unique way of generating central nervous system cell cultures from embryonic day 17 mouse brains for neuro(immuno)logy research. This model can be analyzed using various experimental techniques, including RT-qPCR, microscopy, ELISA, and flow cytometry.

Embriyonik Fare Beyinlerinden Enfeksiyonu ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Karışık Nöronal ve Glial Hücre Kültürleri Oluşturmak

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of ...

Embriyonik Neurogenesis çalışmak için bir Model olarak fare arka beyin

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Embriyonik ventral orta beyin Organotipik Dilim Kültürler: dopaminerjik Nöronal Gelişim Eğitim Bir Sistem In vitro

Civciv Embriyo aksonal Yörüngeler ve Synaptic Hedefler Trace için Beyin elektroporasyon

Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi

NF-KB-bağımlı yetişkin nöron Modülasyon ve Analiz Yöntemleri

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Fare Beyin

Erken Postnatal fare beyin içine Interneuron öncüleri Homochronic nakli

Embriyonik Fare Beyinlerinden Enfeksiyonu ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Karışık Nöronal ve Glial Hücre Kültürleri Oluşturmak

Embriyonik Fare Beyinlerinden Enfeksiyonu ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Karışık Nöronal ve Glial Hücre Kültürleri Oluşturmak

Embriyonik Fare Beyinlerinden Enfeksiyonu ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Karışık Nöronal ve Glial Hücre Kültürleri Oluşturmak