אנו מודים Vasiliki Chantzara על ביצוע matings מתוזמן וצוות של יחידת המשאבים הביולוגיים-מכון עיניים של UCL עבור גידול העכבר. מחקר זה נתמך על ידי Wellcome אמון פרס החוקר 095623/Z/11/Z כדי CR.

כל העבודה בעלי חיים בוצע לפי משרד הפנים בריטניה והנחיות אתיות מקומיים.
1. סיכום השלבים והתזמון
<ol><li>בצע matings מתוזמן של עכברים בוגרים מתוך זן מתאים לענות על השאלה ביולוגיות. תחת חקירה כדי להשיג הריונות 9.5-e13.5 מתחלקים היום (ה); דורשת 12-15 ימים.</li>
	<li>לחלופין, להכין 5-ברומו-2'-deoxyuridine (BrdU) / 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (אדו) פתרון לבצע הזרקה (פרוטוקול בסעיף 2); דורש ~ h 1 ביום שלפני או ביום של בידוד העובר, בהתאם לאורך הרצוי של עידו/BrdU תיוג.</li>
	<li>לבצע חיתוך בידוד, hindbrain העובר (פרוטוקול בסעיף 3); דורש ~ 10 min/העובר.</li>
	<li>לבצע תיוג (פרוטוקול סעיף 4); immunofluorescence wholemount דורש 3 ימים.</li>
	<li>סעיף באמצעות vibratome ולבצע צף immunofluorescence סעיף תיוג (פרוטוקול סעיף 4): דורש 2 ימים.</li>
	<li>סעיף באמצעות cryostat ולבצע immunofluorescence תיוג של cryosections (פרוטוקול בסעיף 5); דורש 2 ימים.</li>
</ol>2. להזריק את העכבר נקבה בהריון עם BrdU או אדו (אופציונלי)
<ol><li>להמיס BrdU או אדו פוספט סטרילי buffered תמיסת מלח (PBS) ריכוזי של 10 מ"ג/מ"ל, 1 מ"ג/מ"ל, בהתאמה. התראה: BrdU ואדו הם רעילים; לענוד הגנה הולמת.</li>
	<li>שוקל את העכבר בהריון ולחשב את עוצמת הקול של BrdU או אדו פתרון זה צריך להיות מנוהל על מנת להגיע 100 מ"ג/ק"ג BrdU או 5 מ"ג/ק"ג אדו.</li>
	<li>מזריקים BrdU או אדו פתרון דרך המסלול בקרום הבטן או 1 h או 1 יום לפני איסוף העוברים, בהתאם לאורך חובה תיוג. הערה: תיוג עבור 1 h מדמיין hindbrain תאים בשלב-S. תיוג עבור יום אחד מדמיין הוא צאצא. של hindbrain NPCs.</li>
</ol>3. ניתוח Hindbrains מ- e9.5 - e13.5 העכבר עוברי
<ol><li>המתת חסד עכבר נקבה בהריון-תוזמן באמצעות הליך אתית שאושרו בשלב הריון הדרושים (למשל, נקע בצוואר הרחם). באמצעות מספריים חדות, לחתוך חלל הצפק, בזהירות לסלק את הרחם. מקם את הרחם נכרת המכיל את העוברים לתוך צלחת פלסטיק 60 מ מ המכיל 20 מ"ל PBS קר כקרח. הערה: הטכניקה Aseptic אינה נדרשת.</li>
	<li>לבצע כל ניתוח נוסף באמצעות מיקרוסקופ ויבתר. באמצעות שען מלקחיים מספר 5, דמעה על הקיר שריר הרחם כדי לחשוף את העוברים, שחרר כל העובר על-ידי ניתוק הטבור ולהסיר את שק החלמון.</li>
	<li>באמצעות פיפטה סטרילי של פסטר עם wide-משעמם פתיחה, להעביר כל העובר לתוך צלחת פלסטיק נקי עם PBS קר כקרח.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים שען מספר 55, סבר הראש (איור 1E).</li>
	<li>באופן אופציונלי, שומרים על חתיכה קטנה של רקמות (למשל, ¼ של שק חלמון או כ 2 מ מ קצה הזנב) בידוד דנ א גנומי, genotyping עוקבות.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים שען מספר 55, לסלק את הרקמה המכילה את hindbrain מקביל ל ומתחת מיד את neuroepithelium hindbrain כדי להפרידו מרקמות ופנים הקדמי (איור 1F).</li>
	<li>מקם את hindbrain ואת הצד הגבי סימטרית רקמות ראש למעלה ולזהות הנוזליםth 4, המכוסה על ידי שכבה רקמה דקה (צלחת גג). בזהירות לנקב את הצלחת גג באמצעות מלקחיים שען מספר 55 (איור 1 ג'י) ולהתקלף רקמות עודף משם עם מלקחיים, מעבר rostrally לאורך קו האמצע המוח האמצעי, ולאחר מכן הקליפה על hindbrain האחורי ועל חוט השדרה (איור 1 ג'י ); hindbrain צריך להיחשף עכשיו בהכנה ספר פתוח (איור 1 H).</li>
	<li>היכונו hindbrains wholemount immunolabeling (אפשרות 1).<ol>
<li>באמצעות שען מלקחיים מספר 55, בזהירות להקניט משם מזנכימה ראש הנותרים ואת כל קרומי המוח מחוברים לצד pial hindbrain באמצעות מלקחיים (איור 1I). הסר את המוח האמצעי ואת רקמת חוט השדרה (איור 1J) להשאיר רק את הרקמה hindbrain (איור 1 K). הערה: שלב זה של ההליך צריכה לא להיות מלווה e9.5 או e10.5, כי מנסה לעשות זאת סביר להניח ולפגיעה את neuroepithelium hindbrain; יתר על כן, הסרת קרומי המוח אינה חיונית, כי neuroepithelium hindbrain דליל מספיק בשלב זה כדי לאפשר חדירה יעיל של נוגדנים עבור immunolabeling. שלב זה צריך, עם זאת, לפעול לפיהם מ e11.5 ואילך, מאחדת את הרקמה של קרום המוח, כדי לשפר את הנוגדן לחדירה neuroepithelium hindbrain. ניתוח היא הקלה כאשר מבוצעת ב- PBS קר כקרח (שימוש, נקי PBS עבור כל hindbrain).</li>
	</ol>
</li>
	<li>היכונו hindbrains vibratome ו- cryosectioning (אפשרות 2)<ol>
<li>בעזרת מלקחיים שען מספר 55, הסר את המוח האמצעי ואת רקמת חוט השדרה (איור 1J). הערה: אין צורך להסיר מזנכימה, קרומי המוח של hindbrains מיועד חלוקתה (כפי שמוצג באיור 1I).</li>
	</ol>
</li>
	<li>להעביר hindbrains צלחת פלסטיק עגול עם תחתית mL 2 צינורות באמצעות פיפטה של פסטר, תשאף כל PBS, תקן עבור 2 h ב 4° C עם עדין-עצבנות בפורמלין המופשרים טרי 4% w/v מומס PBS. התראה: פורמלדהיד הוא רעיל; לענוד הגנה הולמת.</li>
	<li>לשטוף hindbrains 3 x פעמים עם PBS. לאחסן ב 4 ° C ב- PBS אם immunolabeling להתחיל בתוך 2-3 ימים או להחליף PBS עם 50% methanol/50% PBS במשך 5 דקות לפני העברת 100% מתנול לאחסון ארוך ב-20מעלות צלזיוס.
</li>
</ol>4. Wholemount Immunofluorescence
<ol><li>אם נדרש, נוזלים hindbrains באופן סדרתי ומקטין דילולים של מתנול ב- PBS (למשל, 75% מתנול, 50% מתנול, 25% מתנול) בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 דקות ולאחר מכן להעביר ל- PBS. הערה: סדרה מדורגת של מתנול נדרש להחזיר נוזלים hindbrains בעדינות ולהבטיח שימור הרקמה הנכונה.</li>
	<li>Permeabilize hindbrains למשך 30 דקות ב 4 ° C ב- PBS המכיל 0.1% X-100 טריטון (PBT) עם עצבנות עדין.</li>
	<li>דגירה hindbrains עבור h 1 ב 4 ° C ב- PBT המכיל 10% סרום להשבית חום עז עם עצבנות עדין. הערה: להשתמש בסרום מן המינים מארח שגדלו הנוגדנים משני שם. עבור ראשי נוגדנים העולות עז, דגירה, סרום ללא חלבון לחסום, למשל 5% שור אלבומין PBS או חלופה המסחרי (ראה טבלה של חומרים). פעולה זו תקטין את שאינם ספציפיים מכתים נצפו לעתים קרובות באמצעות נוגדנים העיקרי העולות עז.</li>
	<li>דגירה hindbrains בין לילה ב 4 ° C ב- PBT המכיל 1% לא פעיל חום סרום נוגדנים ראשי עם עצבנות עדין (לדוגמה, ארנב אנטי-פוספו היסטון H3 [pHH3] מדולל 1:400). הערה: עבור ראשי נוגדנים העולות עז, השתמש PBT ללא סרום.</li>
	<li>לשטוף את hindbrains ב 4 ° C 5 x עם PBT עבור 1 h.</li>
	<li>דגירה hindbrains בין לילה ב 4 ° C ב- PBT המכיל המתאים fluorophore מצומדת משני נוגדנים (למשל, עז נגד ארנב אלקסה עבור חיל הים 488) ב- 1:200 ב- PBT המכוונים נגד נוגדנים העיקרי בשימוש. לשמור hindbrains בחושך מכאן על להגן על fluorophores photobleaching. הערה: נוגדנים העיקרי העולות עז, לשימוש שברי Fab עז נגד נוגדנים משניים כדי להפחית שאינם ספציפיים מכתים.</li>
	<li>לשטוף את hindbrains ב 4 ° C 5 x עם PBT עבור 1 h.</li>
	<li>Postfix את hindbrains בפורמלין 4% ב- PBS למשך 15 דקות ב RT לשימור לטווח ארוך של הנוגדן מחייב. בקצרה לשטוף פעמיים ב- PBS.</li>
	<li>מכסה זכוכית מיקרוסקופ שקופית עם שתי שכבות של איזולירבנד שחור, בלו כיכר קטנה מהקלטת בשכבות כדי ליצור כיס גדול מספיק כדי להכיל hindbrain אחד.</li>
	<li>העברת כל hindbrain לתוך כיס עם פיפטה פסטר, להסיר עודפי נוזלים ולהוסיף ריאגנט antifade המתאים של הכיס לפני וכיסה אותו לאט לאט coverslip זכוכית כדי למנוע השמנה בועות אוויר תחת coverslip. לסגור את coverslip, ולהצמיד אותו לשקופית עם שכבה דקה של לק. לאחסן שקופיות ב 4 ° C בחושך עד ייבוא תמונות (פרוטוקול סעיף 7).</li>
</ol>5. Vibratome חלוקתה, צף סעיף Immunofluorescence
<ol><li>אם נדרש, נוזלים hindbrains של מתנול כפי שמתואר בשלב 4.1.</li>
	<li>להטביע hindbrains מותכת agarose w/v של 3%, המבושלות מים מזוקקים. הערה: אפשר agarose מותכת להתקרר כ 55 מעלות בקצרה לפני הטמעת כדי למנוע נזק חום hindbrain.</li>
	<li>חותכים hindbrain רוחבי מקטעים לעובי מיקרומטר 70 באמצעות של vibratome. העברת כל מקטע טרי חתוך באמצעות מברשת צבע לתוך אחד טוב של צלחת 24-ובכן המכיל PBS קר כקרח.</li>
	<li>תווית הסעיפים צף כמתואר בצעדים 4.2-4.7, אבל לשנות את השלבים כדלהלן: תשטוף הצפים סעיפים ב 4 ° C 3 x עם PBT עבור 15 דקות כל אחד, להקטין את זמן הדגירה של נוגדנים משניים 2 h, דגירה של נוגדנים משניים-RT.</li>
	<li>לחלופין, לאחר תיוג עם נוגדנים עבור אחרים epitopes כפי שמתואר בשלב 5.4, לזהות גרעינים אדו+ באמצעות להכש תיוג ערכת על פי הוראות היצרן. דגירה בסעיפים צף התגובה קוקטייל במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחושך. תשטוף hindbrain סעיפים ב 4 ° C 3 x עם PBT למשך 15 דקות כל אחד.</li>
	<li>לחלופין, לאחר תיוג עבור אחרים epitopes כפי שמתואר בשלב 5.4, לאתר את הגרעינים BrdU+ כדלקמן.<ol>
<li>דגירה צף ובסעיף 2 חומצה הידרוכלורית N ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך.</li>
		<li>דגירה צף ובסעיף 0.1 M נתרן בוראט מאגר pH 8.5 פעמיים במשך 5 דקות כל אחד ב- RT בחושך כדי לנטרל את חומצת מלח.</li>
		<li>לשטוף צף ובסעיף 3 x בקצרה PBS ב 4 º C.</li>
		<li>לבצע תיוג עבור BrdU כפי שמתואר בשלב 5.4 immunofluorescence.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה הסעיפים צף למשך 2 דקות ב RT ב 10 µg/mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (דאפי) ב- PBS כדי counterstain גרעין התא.</li>
	<li>Postfix הסעיפים צף בפורמלדהיד 4% למשך 15 דקות ב- RT.</li>
	<li>רחץ מקטעים צף בקצרה ב- PBS. בזהירות להעביר מקטעים צף על שקופית זכוכית מיקרוסקופ שימוש במכחול. תנגבי PBS עודף סביב הסעיף באמצעות נייר סופג או רקמה.</li>
	<li>טעינת המקטעים באמצעות 80% גליצרול PBS ואת הכיסוי לאט עם coverslip זכוכית כדי למנוע השמנה בועות אוויר. לאחסן שקופיות ב 4 ° C בחושך עד ייבוא תמונות (שלב 7).</li>
</ol>6. cryostat חלוקתה, Cryosection Immunofluorescence תיוג
<ol><li>אם נדרש, נוזלים hindbrains של מתנול כפי שמתואר בשלב 4.1.</li>
	<li>דגירה hindbrains ב- 30% w/v סוכרוז ב- PBS כדי cryoprotect hindbrains להקפאה. הערה: Hindbrains הם מוכן קפוא כאשר הם טבענו לתחתית של הרכבת התחתית, אשר בדרך כלל לוקח ≤ 2 h עבור hindbrains e9.5-10.5 ו- h 3-6 עבור hindbrains e11.5-13.5.</li>
	<li>להטביע hindbrains בטמפרטורה חיתוך אופטי, מתחם (אוקטובר) ומקפיאים במהירות על ידי העברת תבניות המכילות hindbrains ב- OCT כדי איזופנטאן מקורר בין-40 ° C ל-50 מעלות צלזיוס על קרח יבש. הערה: ניתן לאחסן hindbrains קפואים, מוטבעים ב-20 ° C לטווח הקצר ולטווח הארוך-80 ° C עד חלוקתה.</li>
	<li>חותכים למקטעים hindbrain רוחבי בעובי 10 מיקרומטר באמצעות cryostat העברת שקופיות מיקרוסקופ electrostatically דבק. הערה: ניתן לאחסן Hindbrain cryosections ב-20 ° C לטווח הקצר ולטווח הארוך-80 ° C עד תיוג.</li>
	<li>דגירה שקופיות ב RT למשך 15 דקות לייבוש סעיפים על השקופיות. לשטוף cryosections עם PBS כדי להמיס OCT ומארק מחסום הידרופובי מסביב cryosections באמצעות עט PAP. חזור על שלבים 5.4-5.8.</li>
	<li>חזור על שלב 5.10 באמצעות בינוני פוליוויניל הרכבה על בסיס אלכוהול במקום גליצרול.</li>
</ol>7. ייבוא תמונות
<ol><li>דגימות באמצעות פלורסנטי או מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה בלייזר, מצוידים עם עדשות מתאים שקופיות רכוב מדיה מימית ומסנני מתאים fluorophores משמש immunolabeling.</li>
	<li>כדי דמות את hindbrain שלם או מקטע hindbrain, השתמש עדשה של 10 x הגדלה (למשל, איור 2B); כדי להמחיש hindbrains אזורים על כימות, השתמש 40 X הגדלה (למשל, איור דו-ממדי) וכדי להמחיש תאים בודדים, השתמש עדשה עם 63 x הגדלה (למשל, איור 2C).</li>
</ol>8. שיטות אלטרנטיביות
<ol><li>בעקבות צעד 3.8, homogenize hindbrains מבולבל לייצר השעיה תא בודד עבור cytometry זרימה יישומים15.</li>
	<li>בעקבות צעד 3.8, homogenize hindbrains מבולבל לחלץ RNA לתא בודד המתלים עבור RT-qPCR (למשל, 16). הערה: ודא כל ראגנטים וציוד נשמרים וסטרילי, RNase-מתכווננים כדי למנוע השפלה של RNA.</li>
	<li>בעקבות צעד 3.8, homogenize hindbrains מבולבל כדי לבודד NPCs להפיץ אותם במבחנה כמו neurospheres לניתוח התנהגות NPC hindbrain17. הערה: ודא כל ראגנטים וציוד נשמרים סטרילי למניעת זיהום בקטריאלי/פטרייתי של תרבויות neurosphere.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wilsch-Brauninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortex+expansion+in+development+and+evolution+-+from+cell+biology+to+single+genes.">Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes.</a> Curr Opin Neurobiol. 39, 122-132 (2016).</li><li>Gregg, C., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNTF/LIF/gp130+receptor+complex+signaling+maintains+a+VZ+precursor+differentiation+gradient+in+the+developing+ventral+forebrain.">CNTF/LIF/gp130 receptor complex signaling maintains a VZ precursor differentiation gradient in the developing ventral forebrain.</a> Development. 132 (3), 565-578 (2005).</li><li>Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eomes::GFP-a+tool+for+live+imaging+cells+of+the+trophoblast,+primitive+streak,+and+telencephalon+in+the+mouse+embryo.">Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo.</a> Genesis. 45 (4), 208-217 (2007).</li><li>Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hox+Genes+and+the+Hindbrain:+A+Study+in+Segments.">Hox Genes and the Hindbrain: A Study in Segments.</a> Curr Top Dev Biol. 116, 581-596 (2016).</li><li>Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+axon+guidance+of+cranial+motor+neurons.">Patterning and axon guidance of cranial motor neurons.</a> Nat Rev Neurosci. 8 (11), 859-871 (2007).</li><li>Fantin, A., Vieira, J. M., Plein, A., Maden, C. H., Ruhrberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+mouse+hindbrain+as+a+qualitative+and+quantitative+model+for+studying+the+molecular+and+cellular+mechanisms+of+angiogenesis.">The embryonic mouse hindbrain as a qualitative and quantitative model for studying the molecular and cellular mechanisms of angiogenesis.</a> Nat Protoc. 8 (2), 418-429 (2013).</li><li>Terriente, J., Gerety, S. S., Watanabe-Asaka, T., Gonzalez-Quevedo, R., Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+from+hindbrain+boundaries+regulates+neuronal+clustering+that+patterns+neurogenesis.">Signalling from hindbrain boundaries regulates neuronal clustering that patterns neurogenesis.</a> Development. 139 (16), 2978-2987 (2012).</li><li>Coolen, M., Thieffry, D., Drivenes, O., Becker, T. S., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-9+controls+the+timing+of+neurogenesis+through+the+direct+inhibition+of+antagonistic+factors.">miR-9 controls the timing of neurogenesis through the direct inhibition of antagonistic factors.</a> Dev Cell. 22 (5), 1052-1064 (2012).</li><li>Dias, J. M., Alekseenko, Z., Applequist, J. M., Ericson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tgfbeta+signaling+regulates+temporal+neurogenesis+and+potency+of+neural+stem+cells+in+the+CNS.">Tgfbeta signaling regulates temporal neurogenesis and potency of neural stem cells in the CNS.</a> Neuron. 84 (5), 927-939 (2014).</li><li>Jacob, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid+acid+specifies+neuronal+identity+through+graded+expression+of+Ascl1.">Retinoid acid specifies neuronal identity through graded expression of Ascl1.</a> Curr Biol. 23 (5), 412-418 (2013).</li><li>Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derive+from+the+more+apical+daughter+in+asymmetric+divisions+in+the+zebrafish+neural+tube.">Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube.</a> Nat Neurosci. 13 (6), 673-679 (2010).</li><li>Peretz, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+role+of+hindbrain+boundaries+as+pools+of+neural+stem/progenitor+cells+regulated+by+Sox2.">A new role of hindbrain boundaries as pools of neural stem/progenitor cells regulated by Sox2.</a> BMC Biol. 14, 57 (2016).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by+confocal+microscopy.">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy.</a> J Vis Exp. (26), (2009).</li><li>Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+manipulate+the+fate+of+single+neural+stem+cells+in+tissue.">A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue.</a> Nat Neurosci. 15 (2), 329-337 (2011).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li><li>Hutton, S. R., Pevny, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+expression+levels+distinguish+between+neural+progenitor+populations+of+the+developing+dorsal+telencephalon.">SOX2 expression levels distinguish between neural progenitor populations of the developing dorsal telencephalon.</a> Dev Biol. 352 (1), 40-47 (2011).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+embryonic+mouse+neural+stem+cell+culture+using+the+neurosphere+assay.">Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li><li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+the+neural+tube.">Mitosis in the neural tube.</a> The Journal of Comparative Neurology. 62 (2), 377-405 (1935).</li><li>Sessa, A., Mao, C. A., Hadjantonakis, A. K., Klein, W. H., Broccoli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbr2+directs+conversion+of+radial+glia+into+basal+precursors+and+guides+neuronal+amplification+by+indirect+neurogenesis+in+the+developing+neocortex.">Tbr2 directs conversion of radial glia into basal precursors and guides neuronal amplification by indirect neurogenesis in the developing neocortex.</a> Neuron. 60 (1), 56-69 (2008).</li><li>Pilz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+progenitors+in+the+mammalian+telencephalon+includes+a+new+radial+glial+cell+type.">Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type.</a> Nat Commun. 4, 2125 (2013).</li><li>Fantin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+macrophages+act+as+cellular+chaperones+for+vascular+anastomosis+downstream+of+VEGF-mediated+endothelial+tip+cell+induction.">Tissue macrophages act as cellular chaperones for vascular anastomosis downstream of VEGF-mediated endothelial tip cell induction.</a> Blood. 116 (5), 829-840 (2010).</li><li>Kayam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Pax6+in+the+segmental+organization+of+the+hindbrain.">A novel role for Pax6 in the segmental organization of the hindbrain.</a> Development. 140 (10), 2190-2202 (2013).</li><li>Tata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+embryonic+neurogenesis+by+germinal+zone+vasculature.">Regulation of embryonic neurogenesis by germinal zone vasculature.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), 13414-13419 (2016).</li></ol>

אף אחד מחברי יש אינטרסים מתחרים או האינטרסים המתנגשים.

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש hindbrain עובריים את העכבר כמודל ללמוד על מנגנוני נוירוג'נסיס התפתחותית. באמצעות מגוון של שיטות שונות immunolabeling, hindbrain NPCs ניתן לאבחן, המספר שלהם לכמת בסעיפים רקמות או לאורך איבר wholemounts. הקלות של דיסקציה של האנטומיה שטוח מבטיחה hindbrain יכול לדימות בהכנה 'ספר פתוח' ' כדי לאסוף מידע על דפוסי נוירוג'נסיס איבר רחב.
בהמשך נראה כי הקשורות מחזור התא NPC מיקום ומורפולוגיה NPC, ניתן בקלות לאבחן ב צף- או cryosections של hindbrain. שתי התנהגויות עלול לנצל כדי להגדיר אוכלוסיות חדשות קדמון, כמו בעבר בוצעה ב telencephalon בתרבית של20. לדוגמה, neuroepithelia Sox2+ מעוצב-מוקדם ו Pax6+ הפסגה רדיאלי עכשיו, דונלד נוכחים hindbrain21,22, אבל hindbrain חסרה אבות הבזליים Tbr2+ 3 .
ניתן להתאים כדי לבחון את אופן הפעולה של subpopulations NPC ספציפיים על-ידי תיוג פלורסנט הדמיה חיה ו/או מעקב אחר שושלת היוחסין ברקמות קבוע גם הפרוטוקול המתואר כאן. זו יכולה להיות מושגת, לדוגמה, על ידי לימוד hindbrains של עכברים נושאת את transgene Sox1-iCreERT2 טמוקסיפן-inducible ומן הכתב Rosa26tdTomato 23.
בנוסף להעשרת הידע נוירוג'נסיס מאתר, לומד את hindbrain עשוי להבהיר מנגנונים neurogenic בהרחבה רלוונטיים המשותפים בין המינים, מכיוון hindbrain אזור המוח מאוד שנשמרת צפוי להיות דומה יותר בין המינים חוליות מאשר הקדמי.
כפי hindbrain נוירוג'נסיס מתקיים על חלון זמן יחסית קצר יותר מאשר הקדמי נוירוג'נסיס23, חשוב לשקול הצורך השוואת שלמאחה מבוים עוברי. בהתאם לכך, הטיה ניסיוני הוא נמנע על ידי ספירת להקליט מספר זוגות somite העובר לפני בידוד hindbrain שלה. הרקמה hindbrain עצמה שביר ולא צריך מלקחיים ולכן יטופל בקפידה בעת הפרדת הרקמות hindbrain מזנכימה ראש, קרומי המוח; זוג 'תרגולים' ולכן ייתכן רצוי לפני ניתוח יקר עוברי מתבצע ניסיון. יתר על כן, hindbrains יועבר מהצינור אחד למשנהו באמצעות פיפטה פסטר נשא רחב ולא עם מלקחיים כדי למנוע נזק (הפתיחה של פיפטה הנקבעים על ידי חיתוך של הקצה עם מספריים נקי). לבסוף, נדירה יחסית, מידת השתלבות אדו/BrdU S-פאזי NPCs עלול להיות משתנה, במיוחד במהלך פולסים קצרים (כלומר, 1 h). כדי לשפר את תיוג, להבטיח כי עידו/BrdU התפרקה כראוי לפני טעינת הפתרון לתוך המזרק, להחדיר בזהירות לתוך חלל הצפק. זריקות המסכן, כגון אלה עשויים subcutaneously בטעות, לגרום לאבד או השמנה הפתרון אדו/BrdU ולמנוע אותו מלהיכנס את זרימת הדם.

במהלך התפתחות יונקים, לחלק NPCs חדרית (VZ), אזורי (SVZ) subventricular neuroepithelium מתרחבת כדי ליצור נוירונים חדשים בתהליך הנקרא 'נוירוג'נסיס'. הדור של נוירונים חדשים, מבשרי NPC שלהם נחקר בהרחבה הקדמי1, בעוד פחות ידוע על תהליך זה באזורים אחרים.
הקדמי הוא מקופל מסובכת ומורכבת מבנה, הוא למד בעיקר עם שיטות היסטולוגית לאחר חלוקתה רקמות, מה שהופך את ההבנה נוירוג'נסיס דפוסי מעבר כל האיבר מאתגר. בנוסף, מחקרים של הקדמי נוירוג'נסיס אינם בהכרח חזוי של התנהגות neurogenic באזורים אחרים במוח או בחוט השדרה. לדוגמה, אשר איתות רמזים עשוי להפיק תגובות שונות על-פני אזורים הנבדלים זה מזה CNS, כפי שנצפה במקרה של ciliary neurotrophic פקטור ו לוקמיה מעכבות פקטור, לקדם התחדשות עצמית של NPCs לרוחב קדושתו ganglionic, אבל נסיעה הבידול של חוט השדרה אבות2. יתר על כן, תת מחלקה של NPCs לאכלס הקדמי לפתח ולתרום באופן משמעותי הרחבה של קליפת המוח1 נעדרים hindbrain חוט השדרה3. . הפוך, זה מתקבל על הדעת כי חוט השדרה ואת hindbrain מכילים יחוברו NPC חלופית לא נוכח בקליפת.
Hindbrain העובר העכבר הוא האזור העתיק אבולוציונית של המוח יונקים ומייצר את המוח, גזע המוח. למרות שימור שלה על פני מינים, יחסית מעט מאוד ידוע על נוירוג'נסיס hindbrain, כולל תת NPC או תקנה שלהם. רוב המחקר hindbrain העכבר התמקדה התהליך של פילוח רקמות, מונע על ידי גנים Hox4ואת המתבנת של הנוירונים הפוסט-mitotic5. בנוסף, hindbrain שימש כמודל ללמוד את המנגנונים של אנגיוגנזה התפתחותי6.
בניגוד hindbrain העכבר, hindbrain דג זברה שימש בהרחבה לעקוב אחר NPC בידול והתקדמות שושלת היוחסין של אורגניזם מודל חוליות (למשל,7,8). הבחורה hindbrain ננקטה גם ללמוד נוירוג'נסיס במהלך הפיתוח חוליות (למשל,9,10). בדומה ה hindbrain דג זברה11, הבחורה hindbrain ניתן בשידור חי עם תמונה ללמוד התנהגות NPC ורגולציה לאורך זמן12. תצפית אורכית מקבילה על ידי הדמיה חיה אינה אפשרית כיום אורגניזמים יונקים, כי הם מפתחים ברחם. יתר על כן, ממוקד מניפולציה באמצעות טכניקות כגון אלקטרופורציה ניתן להחיל בקלות על עוברי דג זברה אל-אווירני עצמאי או אפרוח עוברי ב ovo (למשל,13), אבל טכניקות אלה הם גם יותר מאתגרת ב . פשוט תאכל.
למרות זאת, hindbrain העובר העכבר מתאימה להפליא כדי להגדיר את המנגנונים המולקולריים הסלולר המפקחים נוירוג'נסיס. ראשית, ניתוח של hindbrain העכבר, במקרים רבים, יספק מידע שהוא רלוונטי יותר להתפתחויות בני אדם מזה שהושג דרך לימוד חולייתנים התחתון. יתר על כן, מספר עצום של זנים מהונדסים העכבר זמינים כי יכול גם לשמש לגורל מיפוי NPCs מאתר או לשנות את מנגנוני הרגולציה אללים mutant מכוננת או מותנה של גנים הרלוונטיים. ולבסוף, לאחרונה הוכח כי microinjection של hindbrain חדרית אבות שמחוץ מאפשר לפחות בדיקה קצרה של hindbrain NPC קינטיקה14. עדיין, כיום, מעט מאוד ידוע על הארגון ייתכן ועל ההתנהגות של hindbrain NPCs בהקשר כל האיבר.
. הנה, נדגים שיטה פשוטה ומהירה לשימוש את hindbrain כמודל עוצמה לניתוח התנהגות NPC בתרבית של ההכנות wholemount ומקטעים רקמות. אנו מספקים נוסף פרוטוקולים להשתמש immunolabeling ללמוד פרמטרים שונים נוירוג'נסיס תהליך hindbrain דגימות נוספות ליישומים מולקולרית במורד הזרם כגון כמותיים רוורס טרנסקריפטאז (לרביעיית)-PCR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock)</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">211-2120</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Plastic cell culture dish, 60 mm</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">150288</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Cell culture plates, 12-well</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">150628</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:97px;">Copan</td>
			<td style="width:119px;">200C</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Dumont Watchmaker forceps, no. 5</td>
			<td style="width:97px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">91150-20</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Dumont Watchmaker forceps, no. 55</td>
			<td style="width:97px;">FST</td>
			<td>11295-51</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">29G needle/syringe</td>
			<td style="width:97px;">BD</td>
			<td>BD Micro-Fine +1ml</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Anti-phospho-histone H3 primary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Millipore</td>
			<td>06-570</td>
			<td style="width:291px;">Goat, dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Anti-BrdU primary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Abcam</td>
			<td>ab6326</td>
			<td style="width:291px;">Rat, dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Anti-Ki67 primary antibody</td>
			<td style="width:97px;">BD Biosciences</td>
			<td>550609</td>
			<td style="width:291px;">Mouse, dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:257px;">Anti-RC2 primary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>RC2</td>
			<td style="width:291px;">Mouse (IgM), dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A11029</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A11037</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A21042</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A11001</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A11007</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td style="width:291px;">Use at 10 &#956;g per mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">5-ethynyl-2&#8217;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">900584</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">5-bromo-2&#180;-deoxyuridine (BrdU)</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B5002</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">C10086</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Heat-inactivated goat serum</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9023</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7906</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">DAKO protein-block serum free</td>
			<td style="width:97px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">X0909</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Phosphate buffer saline</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Sodium tetraborate</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B9876</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Sucrose</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Agarose</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9539</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Super PAP pen liquid blocker</td>
			<td style="width:97px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">22309</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">SlowFade Antifade Kit</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S-2828</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Glycerol</td>
			<td style="width:97px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10337700</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Mowiol</td>
			<td style="width:97px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">475904</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">OCT</td>
			<td style="width:97px;">Scigen</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Isopentane</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M32631</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Methanol</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">10675112</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">10316380</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">631-0912</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Superfrost microscope slides</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">631-0108</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Thermometer</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">620-0858</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Cover glass</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">631-0137</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Stereo Microscope, Leica MZ16</td>
			<td style="width:97px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">not applicable</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Confocal laser scanning microscope&#160; LSM710</td>
			<td style="width:97px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">not applicable</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mouse hindbrain as a model for studying embryonic neurogenesis

העכבר עובר הקדמי היא מערכת הנפוצות ביותר ללמוד נוירוג'נסיס יונקים במהלך הפיתוח. עם זאת, neuroepithelium הקדמי מאוד מקופל אינה לבצע ניתוח wholemount לבחון דפוסי נוירוג'נסיס איבר רחב. יתר על כן, הגדרת המנגנון של הקדמי נוירוג'נסיס אינה בהכרח חזוי של נוירוג'נסיס בחלקים אחרים של המוח; לדוגמה, בשל נוכחותם של תתי סוגים ספציפיים הקדמי קדמון. העכבר hindbrain מספק מודל אלטרנטיבי ללמוד נוירוג'נסיס עובריים זה לבצע ניתוח wholemount, כמו גם רקמות מקטעים כדי לבחון את התפלגות ייתכן וההתנהגות של אבות עצבית. יתר על כן, זה הוא בקלות גזור עבור יישומים אחרים במורד הזרם, כגון ניתוח בידוד או ביולוגיה מולקולרית של התא. כפי hindbrain העכבר ניתן לנתח בקלות במספר העצום של כתב היוחסין תא וללחצים בעכבר מוטנט שהפכו זמינים, הוא מציע מודל חזק לימוד מנגנונים תאית ומולקולרית נוירוג'נסיס התפתחותית ב מידע יונקים . אורגניזם. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה ומהירה לשימוש hindbrain העובר את העכבר עבור ניתוח בתרבית של קדמון עצבית בהתנהגות התא (NPC) ב wholemount ההכנות ומקטעים רקמות.

סעיף זה ממחיש דוגמאות של תוצאות ניתן להשיג כשלמדתי נוירוג'נסיס ב hindbrain עובריים העכבר דרך ניתוח סעיף wholemount ורקמות.
אנו מראים את immunolabeling wholemount של hindbrain microdissected עם נוגדן עבור pHH3 סמן mitotic מדמיין חלוקת NPCs ב VZ (איור 2B – D). אנחנו מראים pHH3+ NPCs בהגדלה כדי להדגיש שלבים שונים של מיטוזה (איור 2C). לנו יש מאויר זה תיוג בשיטה זו מתאים שיבוצע על פני מספר שלבים רצופים של פיתוח hindbrain לבחון את מהלך הזמן NPC מיטוזה באיבר זה (איור דו-ממדי).
אנחנו מראים כי הדמיה immunolabeled רוחבי vibratome חלקים hindbrain 1 h לאחר ההזרקה אדו, מדמיין את הכיוון המחשוף של mitotic NPCs (איור 3B), התבנית ההעברה גרעיני pseudostratified, interkinetic של רכיבה על אופניים אבות18 (איור 3B, D), המבנה VZ הכולל (איור 3B – D). שימו לב כי pHH3 mitotic+ NPCs נמצאים רק על פני השטח חדרית, לא יותר basally (איור 3C), אשר ניגודים הדפוס חטיבת הבזליים של NPCs מחויב יותר הקדמי19.
אנחנו גם מדגימים איך רכיבה על אופניים NPCs ואת צאצאיהן הבדיל ניתן שכותרתו עם BrdU או EdU כדי להעריך את התקדמות שושלת היוחסין NPC (איור 4). Immunolabeling של cryosections רוחבי של hindbrain העכבר 1 יום לאחר ההזרקה BrdU עבור BrdU ו Ki67מדגים המספר ובמיקום של טיולי אופניים NPCs neuroepithelium (איור 4A, B), לפיה המספר חידוש עצמי NPCs יכולה להיות מוגדרת על-ידי חישוב אחוז Ki67+ BrdU+ תאים בין כל התאים BrdU+ (איור 4A, ג).
לבסוף, אנו מראים דוגמה immunolabeling סעיפים vibratome hindbrain עבור RC2, אנטיגן של חוט הלהט ביניים עצבית ספציפית nestin, לדמיין NPC endfeet (איור 5B) ותהליכים (איור 5C). קטעים Vibratome, במקום cryosections דק, לאפשר תצפית משופרת של NPCs מסועף מאוד וגם המבנה הכללי של neuroepithelial.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig1.jpg"> איור 1 : המפתח נכנס ניתוח hindbrain מעוּבּר העכבר e11.5. (A – D) תיאור סכמטי של hindbrain microdissection. (א) הרקמה ראש סימטרית יוסר על ידי ניתוק לאורך הקווים המנוקדים אדום. (B) הצלחת גג פירסינג, אז נקרע משם הן rostral והן סימטרית הכיוונים לאורך הקו האמצעי (קווים אדומים אנכי) ולאחר מכן רוחבית כדי לחשוף את neuroepithelium hindbrain. (ג) neuroepithelium זה לחטט הרחק קרומי המוח לאחר הוספת המלקחיים שבין שני המבנים, רקמות המוח האמצעי חוט השדרה מוסרות באמצעות ניתוק הרקמה עם המלקחיים לאורך הקווים המנוקדים אדום. (ד) הליך זה מניב hindbrain שעברו שיטוח. (E–K) לכידת תמונה של השלבים העיקריים בהליך hindbrain microdissection. (E) העובר הוא ערף באמצעות ניתוק לאורך הקו המנוקד. (F) hindbrain את החדרth 4, המוקפים צלחת הגג, הן טוחנות ואת הופרדו הראש באמצעות ניתוק לאורך הקווים המקווקווים. (G) הנוזליםth 4 הוא orientated כלפי מעלה לפני חור קטן היא מנוקבת על המשקולת גג (כוכבית). החור מורחב על ידי פילינג הרקמה בקפידה גם rostrally וגם הקליפה לאורך הקו האמצעי (חיצים) לחשוף את hindbrain. Hindbrain הוא ממוקם בצד pial למטה, משמאל שמתקפל לתוך הכנת ספר פתוח (H; שחור ראש החץ מצביע על רקמה עצבית hindbrain). אם hindbrain נדרשת עבור wholemount immunolabeling, קרום pial תוסר מסען בעדינות את neuroepithelium hindbrain של הממברנות של קרום המוח שמסביב באמצעות מלקחיים (אני). עודף המוח האמצעי (mb) וחוט השדרה (sc) רקמה היא שהוסר (קווים מנוקדים ב J) כדי לבודד את hindbrain (K). סרגל קנה מידה: מיקרומטר 500 עבור (E), 300 מיקרומטר עבור ( KF – ). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig2.jpg"> איור 2 : Wholemount immunolabeling יכול לשמש כדי לכמת NPC mitoses על פני hindbrain. (א) מפרטים טכניים הממחישות en פנים הדמיה של NPCs mitotic לשכבת hindbrain חדרית. V, hindbrain חדרית צד; P, pial hindbrain בצד. (B) סריקה אריח קונאפוקלית z ערימת hindbrain e10.5 בעקבות wholemount immunolabeling עבור mitotic סמן pHH3 (אדום). התיבה הלבנה מציינת את האזור מוצג בהגדלה גבוהה יותר בלוח השני (D). (ג) קדם "אנאפאזה" (ראש חץ לבן) ודמויות mitotic "אנאפאזה" (ראש חץ שחור) הם ניתן להבחנה בתוך קבוצה הכוללת כמובן mitotic NPCs. (D) הזמן של wholemount pHH3 תיוג של e9.5-13.5. גודל ברים: 500 מיקרומטר (B); מיקרומטר 20 ב (ג); 100 מיקרומטר (D). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig3.jpg"> איור 3 : NPCs רכיבה על אופניים באזור נבטי שלהם ב hindbrain rostral. (א) מפרטים טכניים המתארים את המיקום של mitotic (ירוק) ו- S-פאזי (אדום) NPCs על פני חדרית hindbrain, באזור periventricular, בהתאמה. חתך וירטואלי דרך hindbrain מוצג בהגדלה גבוהה יותר בצד הימין. החץ השחור מציין את כיוון העברת צאצאי NPC זה סוגר את הדפדפן את מחזור התא לעבר אזור בידול. (B) מחסנית z קונאפוקלית של מקטע hindbrain e11.0 צף מעוּבּר קיבל ה 1 אדו הדופק; immunolabeling pHH3, עידו שימש כדי להמחיש mitotic (ירוק) ו- NPCs S-פאזי (אדום), בהתאמה. Hindbrain משטחים מסומנים על ידי קווים מנוקדים; V, hindbrain חדרית צד; P, pial hindbrain בצד. האזור שצוין על-ידי תיבה לבנה מוצג בהגדלה גבוהה יותר ב- שיבוץ; חיצים מציינים מישור המחשוף NPC ב "אנאפאזה", ביחס השטח חדרית. (ג) ערוץ יחיד הצגת pHH3 immunolabeling בלבד. Mitotic NPCs מסומנים באמצעות חץ ציאן; העדר חטיבות הבזליים מציינים Δ. (D) ערוץ יחיד הצגת אדו תיוג בלבד. אדו+ NPCs לאמץ התפלגות pseudostratified עקב ההגירה גרעיני interkinetic שלהם. המרחק NPCs להעביר מהמשטח חדרית ניתן למדוד, כמצוין בקו הכתום מייצג. גודל ברים: 100 מיקרומטר ב (B -D); 10 מיקרומטר בשיבוץ (B). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig4.jpg"> איור 4 : שילוב BrdU עם Ki67 תיוג כדי לקבוע hindbrain NPC התחדשות עצמית הקיבולת. (א) z קונאפוקלית ערימת cryosection hindbrain e10.5 לאחר תיוג Ki67 (ירוק), BrdU (אדום) בעקבות יום 1 BrdU דופק. תאי זוגית-חיובי באזור חדרית הם NPCs שילבו BrdU והוא עדיין עוברים דרך מחזור התא, כמצוין על-ידי תיוג Ki67. היחס של התווית על-ידי שני תאים בין מכלל האוכלוסייה BrdU+ מייצג את אחוז עצמי המתחדש NPCs. (B, C) יחיד ערוצי הצגת Ki67 (B), BrdU (ג) immunolabeling בלבד. תא BrdU+ חסר Ki67, ולכן סביר להניח ביצע את מחזור התא מציינים לצורת ראש חץ ציאן (A,C). Hindbrain משטחים מסומנים על ידי קווים מנוקדים; V, hindbrain חדרית צד; P, pial hindbrain בצד. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig5.jpg"> איור 5 : Nestin immunolabeling מדמיין תהליכי NPC, endfeet. (A – C) Immunofluorescence עבור RC2, אשר מזהה את epitope על חוט הלהט ביניים עצבית nestin, מדגים NPC מורפולוגיה לרוחב neuroepithelium hindbrain. (א) מחסנית z קונאפוקלית של מקטע צף מ hindbrain e11.5 בעקבות RC2 immunolabeling; התחומים מוצגים בהגדלה גבוהה יותר ב (ב', ב'; אזור הפסגה/חדרית) ו- (C, ג '; הבזליים אזור). Hindbrain משטחים מסומנים על ידי קווים מנוקדים; V, hindbrain חדרית צד; P, pial hindbrain בצד. (B, C) Z קונאפוקלית ערימות של התחומים ב- (א); מוצגים קטעים אופטי יחיד (ב', סי '), בהתאמה. Endfoot הפסגה NPC מעוגן על פני חדרית מסומן על ידי חץ (ב'). NPC fasciculated ותהליכי יחיד מסומנים באמצעות ראשי חץ שחור ולבן ב (סי '), בהתאמה. גודל ברים: 100 מיקרומטר, (א); מיקרומטר 25 (ב, ג). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis at JoVE.com

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

העכבר Hindbrain כמודל ללימוד נוירוג'נסיס עובריים

מאמר זה מדגים כיצד hindbrain עובריים העכבר יכול לשמש כמודל לומד נוירוג'נסיס התפתחותית כל האיבר והן ההכנות בסעיף רקמות.

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

the-mouse-hindbrain-as-a-model-for-studying-embryonic-neurogenesis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.9K Views.  UCL Institute of Ophthalmology. מאמר זה מדגים כיצד hindbrain עובריים העכבר יכול לשמש כמודל לומד נוירוג'נסיס התפתחותית כל האיבר והן ההכנות בסעיף רקמות.

Video: The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

סימון תאים הדמיה למוח האחורי של דג הזברה

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

A Procedure for Studying the Footshock-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking in Laboratory Rats

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse. Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been used extensively to study the neurobiology and phenomenology of relapse to drug use. Although procedural variations have emerged over the past several decades, the most conventional reinstatement procedures are based on the drug self-administration (SA) model. In this model, an animal is trained to perform an operant response to obtain drug. Subsequently, the behavior is extinguished by withholding response-contingent reinforcement. Reinstatement of drug seeking is then triggered by a discrete event, such as an injection of the training drug, re-exposure to drug-associated cues, or exposure to a stressor 1.
Reinstatement procedures were originally developed to study the ability of acute non-contingent exposure to the training drug to reinstate drug seeking in rats and monkeys 1, 2. Reinstatement procedures have since been modified to study the role of environmental stimuli, including drug-associated cues and exposure to various forms of stress, in relapse to drug seeking 1, 3, 4.
Over the past 15 years, a major focus of the reinstatement literature has been on the role of stress in drug relapse. One of the most commonly used forms of stress for studying this relationship is acute exposures to mild, intermittent, electric footshocks. The ability of footshock stress to induce reinstatement of drug seeking was originally demonstrated by Shaham and colleagues (1995) in rats with a history of intravenous heroin SA5. Subsequently, the effect was generalized to rats with histories of intravenous cocaine, methamphetamine, and nicotine SA, as well as oral ethanol SA 3, 6.
Although footshock-induced reinstatement of drug seeking can be achieved reliably and robustly, it is an effect that tends to be sensitive to certain parametrical variables. These include the arrangement of extinction and reinstatement test sessions, the intensity and duration of footshock stress, and the presence of drug-associated cues during extinction and testing for reinstatement. Here we present a protocol for footshock-induced reinstatement of cocaine seeking that we have used with consistent success to study the relationship between stress and cocaine seeking.

Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been used extensively to study the role of stress in relapse to drug seeking. Here, we report on a method for inducing the reinstatement of cocaine seeking in laboratory rats via acute exposures to mild, intermittent electric footshock.

נוהל לימוד החזרה Footshock-induced של קוקאין מחפשים אצל חולדות מעבדה

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse.  Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

הקמת עכבר עובריים גזע עצביים תרבית תאים באמצעות Assay Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. Neuroepithelial cells of the neural tube that express Nkx6.1 are the unique precursor cells for spinal motoneurons1. Though postmitotic motoneurons move towards their final position and organize themselves into columns along the spinal tract2,3. More than 90% of all these differentiated and positioned motoneurons express the transcription factors Islet 1/2. They innervate the muscles of the limbs as well as those of the body and the inner organs. Among others, motoneurons typically express the high affinity receptors for brain derived neurotrophic factor (BDNF) and Neurotrophin-3 (NT-3), the tropomyosin-related kinase B and C (TrkB, TrkC). They do not express the tropomyosin-related kinase A (TrkA)4. Beside the two high affinity receptors, motoneurons do express the low affinity neurotrophin receptor p75NTR. The p75NTR can bind all neurotrophins with similar but lower affinity to all neurotrophins than the high affinity receptors would bind the mature neurotrophins. Within the embryonic spinal cord, the p75NTR is exclusively expressed by the spinal motoneurons5. This has been used to develop motoneuron isolation techniques to purify the cells from the vast majority of surrounding cells6. Isolating motoneurons with the help of specific antibodies (panning) against the extracellular domains of p75NTR has turned out to be an expensive method as the amount of antibody used for a single experiment is high due to the size of the plate used for panning. A much more economical alternative is the use of lectin. Lectin has been shown to specifically bind to p75NTR as well7. The following method describes an alternative technique using wheat germ agglutinin for a preplating procedure instead of the p75NTR antibody. The lectin is an extremely inexpensive alternative to the p75NTR antibody and the purification grades using lectin are comparable to that of the p75NTR antibody. Motoneurons from the embryonic spinal cord can be isolated by this method, survive and grow out neurites.

An alternative way of isolating mouse embryonic motoneurons from the spinal cord is described. The method takes into account the fact that lectin can bind to the low affinity nerve growth factor receptor p75NTR. This lectin-based preplating allows a purification similar to that with a specific antibody against the p75NTR.

לקטינים מבוססי בידוד תרבות Motoneurons עכבר עובריים

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

שיטות לחקר מנגנוני פעולה של אנטי פסיכוטיות סמים ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets containing specific growth factors that trigger blood vessel growth throughout the naturally avascular cornea, angiogenesis can be measured and quantified. In this assay the angiogenic response is generated over the course of several days, depending on the type and dose of growth factor used. The induction of neovascularization is commonly triggered by either basic fibroblast growth factor (bFGF) or vascular endothelial growth factor (VEGF). By combining these growth factors with sucralfate and hydron (poly-HEMA (poly(2-hydroxyethyl methacrylate))) and casting the mixture into pellets, they can be surgically implanted in the mouse eye. These uniform pellets slowly-release the growth factors over five or six days (bFGF or VEGF respectively) enabling sufficient angiogenic response required for vessel area quantification using a slit lamp. This assay can be used for different applications, including the evaluation of angiogenic modulator drugs or treatments as well as comparison between different genetic backgrounds affecting angiogenesis. A skilled investigator after practicing this assay can implant a pellet in less than 5 min per eye.

The protocol describes the corneal micropocket assay as developed in mice.

קרנית Micropocket Assay: דגם של אנגיוגנזה בעין העכבר

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering the molecular signals that cooperatively guide neuronal migration in the embryonic brain is therefore important to understand how the complex neural networks form which later support postnatal life. Facial branchiomotor (FBM) neurons in the mouse embryo hindbrain migrate from rhombomere (r) 4 caudally to form the paired facial nuclei in the r6-derived region of the hindbrain. Here we provide a detailed protocol for wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains suitable to investigate the signaling pathways that regulate FBM migration. In this method, hindbrains of E11.5 mouse embryos are dissected and cultured in an open book preparation on cell culture inserts for 24 hr. During this time, FBM neurons migrate caudally towards r6 and can be exposed to function-blocking antibodies and small molecules in the culture media or heparin beads loaded with recombinant proteins to examine roles for signaling pathways implicated in guiding neuronal migration.

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the neural tube, but migrate to reach appropriate targets. Facial branchiomotor (FBM) neurons are a useful model to study neuronal migration. This protocol describes the wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains to investigate mechanisms that regulate FBM migration.

עכבר המוח האחורי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבות לחקר הגירת Branchiomotor Neuron פנים

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

<em&gt; במבחנה</emהכנת שרירים עצבים&gt; עכבר למבוגרים ללימוד מאפייני ירי afferents השריר

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

מערכת חוש הריח כמודל לחקר דפוסי axonal צמיחה ומורפולוגיה<em&gt; In vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

העכבר Hindbrain כמודל ללימוד נוירוג'נסיס עובריים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

סימון תאים הדמיה למוח האחורי של דג הזברה

נוהל לימוד החזרה Footshock-induced של קוקאין מחפשים אצל חולדות מעבדה

הקמת עכבר עובריים גזע עצביים תרבית תאים באמצעות Assay Neurosphere

לקטינים מבוססי בידוד תרבות Motoneurons עכבר עובריים

שיטות לחקר מנגנוני פעולה של אנטי פסיכוטיות סמים ב

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

קרנית Micropocket Assay: דגם של אנגיוגנזה בעין העכבר

עכבר המוח האחורי

מערכת חוש הריח כמודל לחקר דפוסי axonal צמיחה ומורפולוגיה