Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (Deutsche Forschungsgemeinschaft) tarafından finanse edildi.

1. Enjeksiyon için DNA ve Cam mikropipetler hazırlanması <ol><li> İyi kaliteli cam mikropipetler amniyotik sıvı kaybı nedeniyle ilk yüksek kürtaj oranını azaltmak için gereklidir. Cam mikropipetler çekmek için prosedür de 13,18,25 belgelenmiştir. Isı = 300,, 1.2 mm çapında kılcal kullanın ayarları p = 500 ile geleneksel bir Sutter P-97 cihazı çekti = 40 çekin; Hız = 50; Zaman = 50. 3 mm &quot;çukur&quot; filamentler (Sutter Instrument FT330B) ile çektirme takın. 2 mm boyutu filamentler bize daha az tatmin edici sonuçlar için vermiştir. Öte yandan, mikropipet ipuçları beveling bizim için sonuçlarını geliştirmek için görünmüyor. </li><li> 1-2 mg / ml bir son konsantrasyona kadar hızlı şekilde yeşil% 0.1 içeren PBS içinde saflaştınldı, endotoksin içermeyen DNA (Hücre Kültürü Sınıf) içinde çözülür. Hızlı Yeşil embriyonik beyin ventrikül görünür enjekte çözüm yapacaktır. </li><li> Cam mikropipet içine DNA çözüm 10 ul yükleyin. </li&gt; <li> Enjeksiyon sistemi (Pico Pompa) veya ağız pipet cam mikropipet bağlayın. </li></ol> 2. Anestezi Bir ısıtma yastığı ve cerrahi aletler ile cerrahi tablo hazırlayın. Embriyoların görselleştirme kolaylaştırmak için soğuk ışık kaynakları açın. Örneğin bir cam boncuk sterilizatör için kullanarak cerrahi aletler dezenfekte edin. Üç farklı anestezi prosedürleri (Tartışma) bu protokol için mümkündür. Burada biz (debisi 0,5 L / dk) anestezi indüksiyonunda izofluran inhalasyon kullanarak, iyi düşünün bir de bakım (akış hızı 1 L / dk) anlatacağız. <ol><li> Boru kısa bir uzunluğu Komesaroff Mark 5 Anestezi Cihazı bağlı bir (yani fare görünür kalır) şeffaf küçük bir kapta hamile fare tanıtmak. </li><li> Izofluran ile buharlaştırıcı doldurun, daha sonra cihaza bağlı oksijen şişe açın. Isofl bir ya da iki darbe Darbeurane / narkoz set in için fare ve saat tutan kaba oksijen (0.5 L / dk) </li><li> Onları kurumasını önlemek ve hemen kendi kafasına akış anestezi maskesi uygun merhem ile göz kapağı, fareyi çıkarın. </li></ol> 3. Laparotomi <ol><li> Isıtma yastığı (aksi takdirde vücut ısısı kurtarma şansı azalan, çok hızlı aşağı gidecek) kadar göbek fare yerleştirin ve bant ile yanlarına dört ayakları sabitleme tarafından yerine gövdesi sabitleyin. Refleks stimülasyon (firma basınç ile örneğin parmak veya kuyruk tutam) yanıt kaybı denetleyerek anestezi derinliği değerlendirin. </li><li> Karın yüzeyi Tıraş ve iodophorpovidone-iyot (Braunoderm) ile dezenfekte edin. </li><li> Karın derisi üzerinde bir uzunlamasına kesik (1-1,5 cm uzunluğunda) olun. Daha sonra periton kesti. Kesi etrafında pamuk gazlı bez yerleştirin. Bir uterin boynuz görünür yapın ve PBS-durulanır gauz üzerine künt forseps ile dikkatli bir şekilde çekine. Çok sık, her zaman (Şekil 2A ve 2B) nemlendirilmiş tutmak için PBS ile rahim durulayın. Tüm işlem sırasında rahim içinde yüksek basınç kürtaj ile sonuçlanan enjeksiyon üzerine sıvı kaybı şansı artan embriyo ilettiğiniz çünkü, sıkı mesometrium veya rahim çekerek kaçının. </li></ol> 4. Beyin Ventrikül içine DNA Enjeksiyon <ol><li> Beyin ventriküller görülebilmesi şekilde rahim tutun. Yaygın olumsuz bir pozisyonda yatıyor bir embriyo yeniden konumlandırmak etmeyin - bu sadece kürtaj şansını artırır. </li><li> Üstten embriyonun kafası bakıldığında, sol ve sağ kortikal hemisfer arasındaki görsel boşluğu veya fissür lokalize. Hemisfer ayırt etmek kolaydır ve içlerinde lateral ventriküller (hedef olmamak), genellikle biraz daha koyu şekiller olarak algılanabilir. Bir embriyo (Figür DNA enjeksiyonu için mükemmel odaklı olduğu bulunursaes 2C ve 2D), bu delmek için rahim duvarı mevcuttur ve aynı anda üçüncü ventrikül girin. Yaklaşık 1 mm delici, rahim duvarı ve kortikal hemisfer arasındaki farkın rostral sonunda delinme buna 45 ° cam mikropipet tutun. Bu şekilde, cam mikropipet ucu beyin (değil yanal ventrikül) (Şekil 2C ve 2D) üçüncü ventrikül girecektir. Bu embriyonik baş çevresinde ilk delmek rahim duvarına (her zaman 45 °) için yararlıdır az olumlu odaklı embriyolarda, kortikal hemisfer arasında doğru pozisyonda mikropipet ucu yerleştirin ve ancak o zaman beyin perfore. Üçüncü ventrikül (iyi bir enjeksiyon yeşil sıvı ile ventrikül doldurur) içine DNA çözüm 1 ul hakkında enjekte edilir. Bir rahim boynuzu tüm embriyolar ile aynı işlemi tekrarlayın. Bu DNA çözümü için bir süre ventriküler sıvı ile eşit karıştırın ve entir ulaşmasını sağlare neuroepithelium. </li></ol> 5. Elektroporasyon için Hipotalamus Hedefleme <ol><li> Üzerinde Elektroporatör açın ve embriyonik yaş (E12.5 için biz 5 kare-dalga darbeleri kullanın, 50 V, 50 msn ON/950 msn OFF) göre ayarlayın. Pozitif kutbu paslanmaz çelik iğne elektrot (CUY550-10) olarak ve negatif kutup yuvarlak düz elektrot (CUY700P4L) olarak kullanın. (Bu, aksi takdirde mevcut değil, sadece bu kadar embriyo çevresinde akar yana elektrotlar, embriyo daha küçük olması önemlidir.) </li><li> Elektroporasyon için olan sırt tarafında (yani deneyci dönük) kadar (bunlardan çoğu gibi) bu embriyoların seçin, ve olan yönelim elverişli değildir bu atın. Bu etanol-dezenfekte parmakları ile veya eldiven ile rahim dokunmak artık güvenlidir. Forseps ile rahim Holding Ancak, elektroporasyon sırasında elektrik akımını bozabilir. </li><li> Pierce amn arasındaki embriyonun başkanı tarafından rahim duvarıiğne elektrot ucu ile aşağı doğru sokmak tarafından iotic kese ve plasenta. Itme blok gibi diğer elin işaret parmağınızı kullanın. Elektrot ucu yaklaşık 5 mm orta beyin (Şekil 2E ve 2F) yaklaşık düzeyinde, amniyon kesesi ve uterus duvar arasında şimdi olmalıdır. Bu &quot;hedef elektrot&quot;, bu nedenle konumunu hipotalamik neuroepithelium parçası transfekte almak için büyük olasılıkla belirlemek unutmayın. Embriyo çok yavaşça elektrotlar arasında &quot;sıkıştırılmış&quot; olmak zorundadır. </li><li> Öte yandan, pozisyon ile embriyo kafası (Şekil 2E ve 2G) ters tarafında rahim dış duvarın yuvarlak yassı elektrod. </li><li> (, 950 msn kapalı, 5 kare dalga darbeleri ON 50 V, 50 msn) gerilim uygulamak için pedal anahtarı kullanın. </li><li> Diğer elin işaret parmağı ile rahim geri tutarak yavaşça rahim iğne elektrot çekin - eğer Amniotik sıvı Patlak duvarından kaybolur, genellikle embriyo kürtaj geçirecek. Tüm embriyolar ile aynı işlemi tekrarlayın. </li><li> Karın içine rahim boynuz dönün ve kalan boynuz içinde enjeksiyon ve elektroporasyon tekrarlayın. </li></ol> 6. Cerrahi Bitirme <ol><li> Tüm embriyoların enjeksiyon ve elektroporasyon sonra, kapatmadan önce serum fizyolojik ile periton boşluğuna önce ve nemli tam olarak konumlandırılmış, çok dikkatli bir şekilde karın geri rahim yerleştirin. </li><li> Cerrahi katgüt (Vicryl poliglaktin 910, 5-0, Ethicon V4914) ile periton dikin. Cilt kullanım kapatılması için methodwith daha dayanıklı sütür (Supramid Naylon, 6-0, Serag Wiessner 07171L TO) &quot;dikiş kesildi&quot;. </li><li> Povidon-iyot (Braunoderm) ile karın yüzeyi dezenfekte edin ve bir non-steroid subkutan anti-inflamatuar (örneğin% 0.9 NaCl içinde Rimadyl içinde 1:10 çözüm 100 ul) veya, daha iyi, met gibi bir opioid enjekteprenorphine (Temgesic,% 0.9 NaCl 0.05 ile 0,1 mg / kg vücut ağırlığı) ağrı gidermek için. </li><li> Anestezi makineden anne çıkarın ve bir ısıtma yastığı ile ısıtılan bir kafes yerleştirin. Tamamen anestezi kurtarıldı kadar sürekli fare izleyin. Daha sonra, onlar enfeksiyon veya ağrı belirtisi olmadan prosedürü gelen kurtarma sağlamak için her gün hayvanları kontrol edin. </li></ol> 7. Sonuçları analiz <ol><li> Analiz istenilen güne göre embriyolar (veya postnatals) hasat. Doğum Sonrası fareler (1 ile 2 günlük) dekapitasyon tarafından öldürüldü. </li><li> Bir önceki elektroporasyon açıklama göre her embriyo ayırın. Bir stereo mikroskop altında beyin incelemek ve uygun bölgede yeşil floresan sinyal (GFP muhabiri itibaren) için mikroskop altında kontrol edin. </li><li> Seçilen beyin &quot;taze&quot; analiz edilebilir:% 4 paraformaldehid kısa bir süre için doku düzeltmek ve agaroz% 4 veya jelatin-bir gömmeklbumin, o zaman bir vibratome tipi cihaz bölümü (Şekil 3). Daha detaylı immünohistokimyasal analizi için (Şekil 4), OKT montaj orta (Doku Tek) gömmek% 30 sakaroz çözüm, beyinde kriyo-koruma sonra kriyostat 20 mikron bölümleri kesti. </li></ol>

<ol>
	<li>Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shocking'+developments+in+chick+embryology:+electroporation+and+in+ovo+gene+expression.">Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).</li><li>Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foreign+gene+expression+in+an+organotypic+culture+of+cortical+anlage+after+in+vivo+electroporation.">Foreign gene expression in an organotypic culture of cortical anlage after in vivo electroporation.</a> Neuroreport. 10, 2319-2323 (1999).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li><li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8.">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294, 1071-1074 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+tend+to+stop+migration+and+differentiate+along+the+cortical+internal+plexiform+zones+in+the+Reelin+signal-deficient+mice.">Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice.</a> J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).</li><li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+patterns+the+neocortex+by+regulating+FGF+positional+signaling.">Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling.</a> Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).</li><li>Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+signaling+centers+expressing+BMP,+WNT+and+FGF+proteins+interact+to+pattern+the+cerebral+cortex.">Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex.</a> Development. 131, 5639-5647 (2004).</li><li>Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+8+regulates+neocortical+guidance+of+area-specific+thalamic+innervation.">Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation.</a> J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).</li><li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Delivery+into+Multiple+CNS+Territories+Using+In+Utero+Electroporation.">Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).</li><li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+Electroporation+followed+by+Primary+Neuronal+Culture+for+Studying+Gene+Function+in+Subset+of+Cortical+Neurons.">In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons.</a> J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E15+Mouse+Embryos.">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).</li><li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E16+Rat+Embryos.">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).</li><li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation.">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> J. Neurosci. Methods. 143, 151-158 (2005).</li><li>Haddad-Tovolli, R., Heide, M., Zhou, X., Blaess, S., Alvarez-Bolado, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+thalamic+differentiation:+gli-dependent+pattern+and+gli-independent+prepattern.">Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern.</a> Front Neurosci. 6, 27 (2012).</li><li>Kataoka, A., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+controls+regional+identity+in+the+developing+thalamus.">Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus.</a> Development. 135, 2873-2881 (2008).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+Utero+Electroporation:+Controlled+Spatiotemporal+Gene+Transfection.">Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).</li><li>Vue, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+signaling+controls+thalamic+progenitor+identity+and+nuclei+specification+in+mice.">Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice.</a> J. Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+the+hypocretin/orexin+gene+by+NR6A1.">Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).</li><li>Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+axonal+projections+from+mammillary+bodies+in+Pax6+mutant+mice:+possible+roles+of+Netrin-1+and+Slit+2+in+mammillary+projections.">Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections.</a> J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).</li><li>Canteras, N. S., Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Nervous System. , 539-562 (2011).</li><li>Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+for+trouble:+a+search+for+developmental+defects+of+the+hypothalamus.">Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus.</a> Horm. Res. 64, 222-230 (2005).</li><li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+ex+vivo+Electroporation+for+Gene+Expression+in+Mouse+Retinal+Ganglion+Cells.">In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells.</a> J. Vis. Exp. (31), e1333 (2009).</li><li>Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., Mackenzie, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+in+Utero+Transplantation.">A Mouse Model of in Utero Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (47), e2303 (2011).</li><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Development+of+the+Rat+Hypothalamus.">The Development of the Rat Hypothalamus.</a> Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 100, 1-178 (1986).</li><li>Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+developmental+time+across+mammalian+species.">Translating developmental time across mammalian species.</a> Neuroscience. 105, 7-17 (2001).</li><li>Clancy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Web-based+method+for+translating+neurodevelopment+from+laboratory+species+to+humans.">Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans.</a> Neuroinformatics. 5, 79-94 (2007).</li><li>Ishii, Y., Bouret, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+birthdate+of+hypothalamic+leptin-activated+neurons+in+mice.">Embryonic birthdate of hypothalamic leptin-activated neurons in mice.</a> Endocrinology. 153, 3657-3667 (2012).</li><li>Karim, M. A., Sloper, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histogenesis+of+the+supraoptic+and+paraventricular+neurosecretory+cells+of+the+mouse+hypothalamus.">Histogenesis of the supraoptic and paraventricular neurosecretory cells of the mouse hypothalamus.</a> J. Anat. 130, 341-347 (1980).</li><li>Shimada, M., Nakamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+of+neuron+origin+in+mouse+hypothalamic+nuclei.">Time of neuron origin in mouse hypothalamic nuclei.</a> Exp. Neurol. 41, 163-173 (1973).</li><li>Alvarez-Bolado, G., Paul, F. A., Blaess, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+lineage+in+the+mouse+hypothalamus:+from+progenitor+domains+to+hypothalamic+regions.">Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions.</a> Neural. Dev. 7, 4 (2012).</li><li>Vann, S. D., Aggleton, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammillary+bodies:+two+memory+systems+in+one.">The mammillary bodies: two memory systems in one.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 35-44 (2004).</li><li>Gratsch, T. E., De Boer, L. S., O'Shea, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+inhibition+of+BMP-4+gene+expression+in+postimplantation+mouse+embryos.">RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos.</a> Genesis. 37, 12-17 (2003).</li><li>Wu, N., Yu, A. B., Zhu, H. B., Lin, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+silencing+of+Sry+gene+with+RNA+interference+in+developing+mouse+embryos+resulted+in+feminization+of+XY+gonad.">Effective silencing of Sry gene with RNA interference in developing mouse embryos resulted in feminization of XY gonad.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2012, 343891 (2012).</li><li>Kikuchi, N., Nakamura, S., Ohtsuka, M., Kimura, M., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+mechanism+of+gene+transfer+into+early+to+mid-gestational+mouse+fetuses+by+tail+vein+injection.">Possible mechanism of gene transfer into early to mid-gestational mouse fetuses by tail vein injection.</a> Gene Ther. 9, 1529-1541 (2002).</li><li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes.">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).</li><li>Xin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+targeting+mechanism+of+Angiopep-conjugated+poly(ethylene+glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone)+nanoparticles.">The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles.</a> Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li><li>Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+for+stable+expression+of+foreign+genes+in+mammalian+cells+by+use+of+the+untranslated+leader+sequence+from+EMC+virus.">Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus.</a> Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Londrigan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+promoters+for+driving+efficient+transgene+expression+in+neonatal+porcine+islets.">Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets.</a> Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Anestezi hakkında: Hipotalamus içine utero elektroporasyon teknik olarak zorlu olması ve daha uzun narkoz kez gerektirebilir yana, oksijen ve izofluran karışımı verilmesi ile anestezi neden ve korumak için tercih. Bizim tecrübelerimize göre, hayvanlar en az, annenin iyileşme çok hızlı, ve embriyo hayatta kalma geliştirilmiş bir saat kadar süre bu şekilde uygun anestezi kalabilir. Anestezi için diğer yaklaşımlar da mevcuttur. En basit bir prosedür intraperitoneal enjeksiyon ile na...

Embriyonik fare beyin genetik manipülasyon gelişimsel düzenleme hakkında bilgi almak için tercih edilen bir yaklaşımdır. Mutant fare hatları üretimi ne kadar yavaş ve pahalıdır. Memeli beyin nöronların geliştirilmesinde belirli genetik değişiklikler tanıtmak için bir güçlü bir yöntem utero elektroporasyon olduğunu. Esasen, teknik daha sonra embriyo, belirli bir zaman süresi boyunca hayatta beyin toplamak ve olası yeni, bilgilendirici, fenotip için bunları incelemeye izin veren elektrik darbeleri vasıtasıyla embriyonik beyin epitele DNA transfekte oluşur. Bu şekilde, fare deneyi mutantlarının üretimi için gerekli olan uzun bekleme süreleri olmaksızın hemen hipotezleri test edebilir. Gelişmekte olan embriyo içine DNA Transfeksiyon civciv embriyoları 1 ovo elektroporasyon ile başladı. Fare için proof-of-concept temel kültüründe yapıldı <s2&gt; kadar. Bu yakında utero 3,4 fare üzerindeki tekniğin ilk açıklamaları izledi. Asıl sorun onları ya da anne öldürmeden rahimde gelişmekte olan embriyo beyin transfect etmektir. (Laparotomi, enjeksiyon, elektroporasyon) gerekli ameliyat öğrenmek uzun bir eğitim süresi gerektirir. Ameliyat embriyo hayatta kalma oranı kabul edilebilir noktaya hakim sonra, bir sonraki önemli bir soru: beyin yapıları erişilebilir olan? Beklendiği gibi, utero elektroporasyon ile elde edilen sonuçlar gösteren ilk yayınlanan bildiri kortikal gelişim 5-9 odaklanmıştır. Cerrahi işlemler için en kolay gelişmekte olan fare beyin bölgesi korteks (Şekil 1), bu durum, bu yöntem kullanılarak yayın çoğu için de geçerlidir. Korteks içine utero elektroporasyon prosedürü tarif edilmiştirbaskı 10 ve video 11-14. Tekniğin bir değişiklik telencephalon bir karın kısmı, bazal ganglion 15 hedeflemek için kullanılabilir. Telencephalon ötesinde, diensefalon (klasik talamus ve hipotalamus ayrılmıştır) ulaşmak için daha zor ön beyin bir bölgedir. Onun dorsal ve en kolay kısmı, talamus 16-19 hedef kağıtları raporların az sayıda. Hipotalamus, ön beyin en karın kısmı bu nedenle bir dorsal yüzeyi (korteks), (Şekil 1) &#39;den en derin lokalize. Bu bölge genetik rahimde fare beyin işlemek için taahhüt araştırmacılar için zor bir sorun olmaya devam etmektedir. Bildiğimiz kadarıyla, sadece çok az sayıda makale fare hipotalamus 20,21 içine utero transfeksiyon içinde sonuçları rapor. Ancak, hipotalamus bulaşmıyor işlevsel önemibu, çiftleşme, üreme ve ebeveynlik 22 yeme ve içme gibi davranışları düzenleyen beri t, abartılmış. Ayrıca, hipotalamik gelişiminde değişiklikler daha sonra obezite, hipertansiyon, diyabet ve erken ergenlik 23 gibi yaşam koşulları kaynaklı katkıda bulunur. Gelişimi sırasında genetik hipotalamus değiştirmek için güçlü olmak bunu anlamak için çok güçlü bir araç sağlayacaktır. Burada kullandığımız gebe farelerin laparotomi için temel cerrahi protokolü diğer protokoller 11,13,14,24 kullanılan benzemektedir. Biz bütünlüğü için kısaca bunları anlatacağız. Bizim prosedüre anahtar, diğer taraftan, anestezi tipi, enjeksiyon yeri, elektrotların türü ve ekleme ve embriyonun kafası ile ilgili olarak pozitif elektrot pozisyonu vardır. Eski sağlar beri, basit intraperitoneal anestezi üzerinden gaz solunması anestezi teşvik ve korumak için tercihnarkozu biraz daha uzun süre zor bir ameliyat için gerekli. Anestezi daha hızlı kurtarma izofluran inhalasyon sonuçları, genellikle anne zaten ameliyattan sonra dakika normal bir davranışı gösterir beri. Cam mikropipet ile DNA çözüm enjeksiyon en kolay nokta ancak hipotalamus elektroporasyon için tamamen uygun değildir lateral ventrikül vardır. Doğrudan üçüncü ventrikül enjeksiyon gerçekten derin diensefalik yapıları hedef için çok önemlidir. Bu standart, off-the-raf elektrotlar ile E12.0 veya E12.5 gelen hipotalamus transfect mümkündür. Biz özellikle bu amaç için uygun Nepa, Gene (Chiba, Japonya) tarafından üretilen bazı elektrodların bulduk. Bizim işlem ile, tüm hipotalamik neuroepithelium veya elektrot yönüne bağlı olarak kısmi, bölgesel aktarılmasının transfeksiyon edinin. Burada muhtemelen, göğüs vücut transfecting tarafından tekniği göstermekderin ve bütün hipotalamik çekirdek en gömme. Buna ek olarak, çözünürlük, hücresel seviyede için transfekte edilmiş hücrelerin ayrıntılı histolojik analizi aşağı göstermektedir. Utero fare gelişen beyin transfecting diğer yaklaşımlarla utero elektroporasyon karşılaştırılması Tartışma bölümünde bulunabilir.

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td>Sanofi GmbH</td><td></td><td>anesthetic</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>HDG9623</td><td>anesthetic</td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Pharma GmbH</td><td></td><td>anesthetic</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Fluka</td><td>44715</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rimadyl</td><td>Pfizer</td><td></td><td>non-steroidal anti-inflammatory</td></tr><tr><td>Braunoderm</td><td>Braun</td><td>3887138</td><td>povidone-iodine</td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Temgesic (buprenorphine)</td><td>Essex Pharma</td><td></td><td>opioid analgesic</td></tr><tr><td>Eye Ointment</td><td>Pan-Ophtal</td><td>7136926</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5</td><td>Medical Developments Australia</td><td>ACN 004 903 682</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Capillary puller P-97</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Compresstome</td><td>Precisionary Instr.</td><td>VF-300</td><td>Vibratome-type device</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Nepa Gene Co. Ltd.</td><td>CUY21EDIT</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Electrode 1</td><td>Nepa Gene Co. Ltd.</td><td>CUY550-10</td><td>Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam.</td></tr><tr><td>Electrode 2</td><td>Nepa Gene Co. Ltd.</td><td>CUY700P4L</td><td>Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter</td></tr><tr><td>Fiberoptic cold light source</td><td>Leica</td><td>KL2500 LCD</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass capillaries</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC120T-15</td><td>1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D.</td></tr><tr><td>Glass bead sterilizer</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST250</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>Harvard Apparatus</td><td>py872-5272</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Injection device</td><td>World Precision Instruments</td><td>Pneumatic Pico Pump PV820</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Suture Thread Coated Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>V4914</td><td>Peritoneal Suture</td></tr><tr><td>Suture Thr. Supramid</td><td>Serag Wiessner</td><td>TO07171L</td><td>Skin Suture</td></tr></tbody></table>

genetic manipulation of the mouse developing hypothalamus through in utero electroporation

Gelişmekte olan memeli beynin belirli bölgelerde genetik modifikasyonu çok güçlü bir deneysel bir yaklaşımdır. Ancak, yeni fare mutantlar üreten genellikle sinir bozucu yavaş. Makul post-operatif sağkalım rahimde gelişmekte olan fare beyin erişimi mümkün olduğu gösterilmiştir. Yine de, bu prosedüre sonuçlar gelişmekte olan beynin en yüzeysel ve kolay erişilebilir kısmı için neredeyse sadece bildirilmiştir, korteks yani. Talamus, daha dar ve daha orta bölgesinden bir hedef, daha zor olduğu kanıtlanmıştır. Özellikle derin çekirdek, hipotalamus bu içine Transfeksiyon, en zorlu ve bu nedenle çok az sonuç bildirilmiştir belki de. Burada tüm hipotalamik epitele veya elektroporasyon ile transfeksiyon için bunun bir parçası (hipotalamik bölgeler) hedef için bir prosedürü göstermektedir. Bizim yaklaşım anahtarları t uzun narkoz kez, enjeksiyon olarakHird ventrikül ve uygun tür ve elektrot konumlandırma. Ayrıca, hedef ve en girintili hipotalamik çekirdek, göğüs vücudun sonraki histolojik analiz sonuçları göstermektedir.

En hipotalamus nöronlar biraz daha kısa fare geliştirme 27,28 tercüme sıçan 26 doğum kalma analizine göre, E11.5 arasında E15.2 için doğarlar. Hipotalamik nöron zirve E12.5 29-31 ulaşılır. Buna göre, bu çalışmada (E12.5) için seçilen transfeksiyon yaşta, hipotalamus nöronları büyük bir kısmı, herhangi bir rostro-kaudal seviyesinde etiketlenebilir. Kalın vibratome tip bölümlerde E18.5 de analizi (Şekil 3A ve <st...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation at JoVE.com

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Hipotalamusun fonksiyonel ve tıbbi önemine rağmen,<em&gt; Utero</emGelişimi&gt; genetik manipülasyon nadiren çalışılmıştır. Biz için ayrıntılı bir prosedür göstermek<em&gt; Utero</emFare hipotalamus ve total ve parsiyel (bölgesel) hipotalamik aktarılmasının gösterisi temsilcisi sonuçlara&gt; elektroporasyon.

Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

genetic-manipulation-mouse-developing-hypothalamus-through-utero

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

15.8K Görüntüleme.  University of Heidelberg. Hipotalamusun fonksiyonel ve tıbbi önemine rağmen, Utero genetik manipülasyon nadiren çalışılmıştır. Biz için ayrıntılı bir prosedür göstermek Utero elektroporasyon.

Video: Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Fare Hipokampal Doku Ex Utero Elektroporasyon ve Organotipik Dilim Kültür

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Gelişim Biyolojisi

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors lining the walls of the lateral ventricle. This technique is now widely used to study the processes involved in corticogenesis by over-expressing or knocking down genes and observing the effects on cellular proliferation, migration, and differentiation. In comparison to traditional knockout strategies, in-utero electroporation provides a rapid means to manipulate a population of cells during a specific temporal window. In this video protocol we outline the experimental methodology for preparing mice for surgery, exposing the uterine horns through laporatomy, injecting DNA into the lateral ventricles of the developing embryo, electroporating DNA into the progenitors lining the lateral wall, and caring for animals post-surgery. Our laboratory uses this protocol for surgeries on E13-E16 mice, however, it is most commonly performed at E15, as shown in this video. 

E15 Fare Embriyolar Utero İntraventriküler Enjeksiyon ve Elektroporasyon

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

Biyoloji

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar&#39;da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Nörobilim

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

In vitro Electroporation of the Lower Rhombic Lip of Midgestation Mouse Embryos

The rhombic lip is an embryonic neuroepithelium located in the hindbrain at the junction between the neural tube and the roofplate of the fourth ventricle (reviewed in 1). The rhombic lip can be subdivided into the upper rhombic lip (URL) which encompasses rhombomere 1 (r1) and generates neurons of the cerebellum and the lower rhombic lip (LRL) which gives rise to diverse neuronal brainstem lineages 2-4. LRL derivatives include the auditory neurons of the cochlear nuclei and those of the precerebellar nuclei that are involved in regulating balance and motor control 5-8. Neurogenesis from the LRL occurs over a large temporal window that encompasses embryonic days (E) 9.5-16.55, 9. Different neuronal lineages emerge from the LRL as postmitotic cells (or are born) during distinct developmental days during this neurogenic window. 
Electroporation of gene expression constructs can be used to manipulate gene expression in LRL progenitors and can potentially change the fate of the neurons produced from this region 10-12. Altering gene expression of LRL progenitors in the mouse via in utero electroporation has been highly successful for manipulating lineages born on embryonic day E12.5 or later 10, 12-14. In utero electroporations prior to E12.5 have been unsuccessful primarily due to the lethality associated with puncturing the fourth ventricle roofplate, a necessary step in delivering exogenous DNA that is electroporated into the LRL. However, many LRL derived lineages arise from the LRL earlier than E12.5 9. These earlier born lineages include the neurons that comprise the lateral reticular, external cuneate, and inferior olivary nuclei of the precerebellar system which function to connect inputs from the spinal cord and cortex to the cerebellum 5. In order to manipulate expression in the LRL of embryos younger than E12.5, we developed an in vitro system in which embryos are placed into culture following electroporation.
This study presents an efficient and effective method for manipulating the gene expression of LRL progenitors at E11.5. Embryos electroporated with green fluorescent protein (GFP) driven from the broadly active CAG promoter reproducibly expressed GFP after 24 hours of culture. A critical aspect of this assay is that gene expression is only altered because of the expression of the exogenous gene and not because of secondary effects that result from the electroporation and culturing techniques. It was determined that the endogenous gene expression patterns remain undisturbed in electroporated and cultured embryos. This assay can be utilized to alter the fate of cells emerging from the LRL of embryos younger than E12.5 through the introduction of plasmids for overexpression or knock down (through RNAi) of different pro-neural transcription factors.

In vitro Electroporation of the Lower Rhombic Lip of Midgestation Mouse Embryos

This study describes the development of an in vitro electroporation technique that allows for the manipulation of gene expression in the lower rhombic lip of midgestation embryos.

Midgestation Fare Embryolarının Alt Rombik Dudak in vitro Elektroporasyon yılında

The rhombic lip is an embryonic neuroepithelium located in the hindbrain at the junction between the neural tube and the roofplate of the fourth ventricle ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously largely been restricted to the manipulation of embryonic stages post-neurulation. A protocol was developed to inject the amniotic cavity at embryonic day (E)7.5 and deliver lentivirus, encoding cDNA or shRNA, targeting &gt;95% of the neural plate and neural crest cells, contributing to the future brain, spinal cord, and peripheral nervous system. This protocol describes the steps necessary to achieve successful transduction, including grinding of the glass capillary needles, pregnancy verification, developmental staging using ultrasound imaging, and optimal injection volumes matched to embryonic stages. 
Following this protocol, it is possible to achieve transduction of &gt;95% of the developing brain with high-titer lentivirus and thus perform whole-brain genetic manipulation. In contrast, it is possible to achieve mosaic transduction using lower viral titers, allowing for genetic screening or lineage tracing. Injection at E7.5 also targets ectoderm and neural crest contributing to distinct compartments of the eye, tongue, and peripheral nervous system. This technique thus offers the possibility to manipulate gene expression in mouse neural-plate- and ectoderm-derived tissues from preneurulation stages, with the benefit of reducing the number of mice used in experiments.

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5

In this protocol, we describe how to inject the mouse amniotic cavity at E7.5 with lentivirus, leading to uniform transduction of the entire neural plate, with minimal detrimental effects on survival or embryonic development.

Embriyonik Gün 7.5'te In Utero Nano-Enjeksiyon (NEPTÜN) ile Murin Nöral Plaka Hedefleme

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Korteks, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- ve Striatum özgü<em&gt; In Utero</em&gt; C57BL / 6 Fare Elektroporasyon

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations

In utero electroporation is an in vivo DNA transfer technique extensively used to study the molecular and cellular mechanisms underlying mammalian corticogenesis. This procedure takes advantage of the brain ventricles to allow the introduction of DNA of interest and uses a pair of electrodes to direct the entrance of the genetic material into the cells lining the ventricle, the neural stem cells. This method allows researchers to label the desired cells and/or manipulate the expression of genes of interest in those cells. It has multiple applications, including assays targeting neuronal migration, lineage tracing, and axonal pathfinding. An important feature of this method is its temporal and regional control, allowing circumvention of potential problems related with embryonic lethality or the lack of specific CRE driver mice. Another relevant aspect of this technique is that it helps to considerably reduce the economic and temporal limitations that involve the generation of new mouse lines, which become particularly important in the study of interactions between cell types that originate in distant areas of the brain at different developmental ages. Here we describe a double electroporation strategy that enables targeting of cell populations that are spatially and temporally separated. With this approach we can label different subtypes of cells in different locations with selected fluorescent proteins to visualize them, and/or we can manipulate genes of interest expressed by these different cells at the appropriate times. This strategy enhances the potential of in utero electroporation and provides a powerful tool to study the behavior of temporally and spatially separated cell populations that migrate to establish close contacts, as well as long-range interactions through axonal projections, reducing temporal and economic costs.

Double in utero electroporation allows targeting cell populations that are spatially and temporally separated. This technique is useful to visualize interactions between those cell populations using fluorescent proteins in normal conditions but also after functional experiments to perturb genes of interest.

Geçici ve Mekansal Olarak Ayrılmış Hücre Popülasyonlarını Hedef lemek için Utero Elektroporasyonunda Çift

In utero electroporation is an in vivo DNA transfer technique extensively used to study the molecular and cellular mechanisms underlying mammalian ...

A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution of specific genes to brain development and function increases. Relying on mouse models to study the role of specific genetic manipulations is not always feasible since transgenic mouse lines are quite costly and many novel disease-associated genes do not yet have commercially available genetic lines. Additionally, it can take years of development and validation to create a mouse line. In utero electroporation offers a relatively quick and easy method to manipulate gene expression in a cell-type specific manner in vivo that only requires developing a DNA plasmid to achieve a particular genetic manipulation. Bilateral in utero electroporation can be used to target large populations of frontal cortex pyramidal neurons. Combining this gene transfer method with behavioral approaches allows one to study the effects of genetic manipulations on the function of prefrontal cortex networks and the social behavior of juvenile and adult mice.

The role of recently discovered disease-associated genes in the pathogenesis of neuropsychiatric disorders remains obscure. A modified bilateral in utero electroporation technique allows for the gene transfer in large populations of neurons and examination of the causative effects of gene expression changes on social behavior.

Kemirgen Davranışı Üzerindeki Genetik Etkileri Sorgulamak için İkili İn Utero Elektroporasyonunu Kullanan Bir Boru Hattı

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution ...

Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler