Name: isolation and ex vivo culture of vδ1+cd4+γδ t cells, an extrathymic αβt-cell progenitor
Uploaded: 2015-12-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Ex Vivo Culture of VÃŽÂ´1+CD4+ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells, an Extrathymic ÃŽÂ±ÃŽÂ²T-cell Progenitor at JoVE.com

Christian Welker is funded by a grant provided by the J&#252;rgen-Manchot-Stiftung.

Etik Beyanı: Tüm işlemler Helsinki Bildirgesi uyarınca yürütüldü ve Tübingen Üniversitesi&#39;nde Klinik Etik Komitesi tarafından kabul edildi (38 / 2009B02 ve 470 / 2013B02 projeler). Periferal Kan Tek Çekirdekli Hücreleri 1. izolasyonu (PBMC) <ol><li> 1000 IU heparin sülfat içeren 50 ml&#39;lik şırınga kullanarak venipunktür yoluyla sağlıklı bir gönüllüden 50-100 ml alın ve kan sulandırmak 1: PBS (pH = 7.2) 2. </li><li> 15 ml kan ayırma çözeltisi üzerine PBS çözeltisi gibi Biocoll olarak (d = 1.077 g / ml), 50 ml konik bir tüp içinde: dikkatlice kan 35 ml katman. Oda sıcaklığında 800 x g&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj. NOT: Fren kullanılmamalıdır. </li><li> Bir pipet ile lenfositik tabakanın hücreleri toplamak ve en az 50 ml PBS içerisinde iki kez yıkama hücreleri (400 x g&#39;de 12 dakika boyunca santrifüj). Bir pipet ile santrifüj sonra süpernatantı. </li><li> Lyse askıya alınması ve inkubasyon suretiyle eritrositler kalan2-4 dakika boyunca, bir hipotonik tampon çözeltisi 1-5 ml lenfositik kısmını bir başlatma. Not: maruz kalma ve liz tampon maddesi hacmi süresi kullanılan parçalama tamponu ve lenfosit fraksiyonunda kalan kırmızı kan hücrelerinin miktarına bağlıdır. </li><li> 12 dakika boyunca 250 xg&#39;de PBS (01:10) ile hücreler ve santrifüj seyreltilir ve daha sonra tekrar süspansiyon ve 12 dakika boyunca 300 x g&#39;de 10 ml PBS içinde bir kez hücre pelletini yıkayın. </li><li> PBS içinde yeniden süspanse lenfositleri ve tripan mavi bir solüsyon kullanımıyla bir Neubauer sayım odası içinde hücreleri sayın. NOT: Genellikle,&gt; 1 x 10 8 lenfositler 100 ml alınan taze periferik kan çekilmiş. </li></ol> Vδ1 T hücreleri 2. İzolasyon <ol><li> Vδ1 CD4 T hücrelerinin frekansı belirleyen bir ilk FACS &lt;1 x 10 6 izole edilen lenfositlerin al. NOT: Bu T-hücresi varlığın Nüfus büyüklüğü bireylere ve onların immünolojik durumuna göre arasında büyük farklılık gösterebilir. Typically, T hücrelerin yaklaşık% 1 Vδ1 + ve Vδ1 + hücreleri, yaklaşık% 1-5 olan CD4 + &#39;dır. <ol><li> PBS,% 2 FCS ve 5 mM EDTA içeren oluşur 1 ml FACS tamponu ile hücreleri seyreltilir. 2 dakika süreyle 660 xg&#39;de Santrifüj ve süpernatant süzün. 100 ul FACS tampon akış hacmi daha sonraki boyama için yeterlidir. Kısaca bir girdap ve 5 ul FACS boyaması etkisi arttığından, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca reaktifi Fc bloke ile hücrelerin inkübe edin. </li><li> Fc bloke edici tepkin madde çıkartılmadan direkt olarak hücrelere insan monoklonal antikor ekleyin. , CD8 (1: 200) ve TCRαβ (01:25): Vδ1 (01:50), CD3 (01:50), CD4 (200 1) karşı antikorlar ile hücrelerin leke emin olun. Karşılık gelen immünoglobulin izotipleri ile izotip kontrolü hazırlayın. Karanlıkta 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca antikorlar ile inkübe hücreleri. </li><li> (2 dakika boyunca santrifüje tabi tutulur; 660 xg) 1 ml FACS tampon maddesi içinde hücrelerin yıkayın, Süpernatant, süzünatant ve kalan tampon hacminde FACS edinimi geçin. </li></ol></li><li> 12 dakika boyunca santrifüj ile (FACS analizi kullanılmaz) hücreler topaklaşmasına; 300 g; 8 ° C. Süpernatantı ve 1 x 10 7 hücre başına 60 ul MACS-tamponu pelletin hücreyi tekrar süspansiyon. 1 x 10 7 hücre başına 20 ul Fc bloke edici tepkin madde ekleyin ve 4 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edilir. </li><li> Şirketinden hücrelere 1 x 10 7 hücre başına 10 ul FITC-konjüge anti-insan Vδ1 antikor ekleyin. Karanlıkta 4 ° C&#39;da 12 dakika kuluçkalayın. </li><li> 14 ml MACS-tamponu kullanılarak hücre yıkayın (12 dakika boyunca santrifüje tabi tutulur; 300 g, 8 ° C). Tamamen Süpernatant atın ve 1x10 7 hücre başına 80 ul MACS tamponu hücrelerin tekrar süspansiyon. </li><li> 1-2 x 10 5 hücre almak ve FACS analizi ile etiketleme doğrulanması için 100 ul FACS tampon maddesi içinde seyreltilmesi. Daha başka katkı maddeleri, bu aşama için ihtiyaç vardır. Bir taşıdıkları risklerle olduğundan emin olunVδ1 için parlaklık cient farkı - ve Vδ1 + hücreler. Bu durumda değilse, tekrar) 2.3) ve 2.4 adımları tekrarlayın. </li><li> Geri kalan hücreler 1 x 10 7 hücre başına 20 ul anti-FITC mikroboncukları ekleyin, iyice karıştırın ve 4 ° C de karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, (300 x g&#39;de, 12 dakika boyunca santrifüje tabi tutulur; 8 ° C), en az 10 ml MACS tamponu ile yıkama hücreleri. </li><li> Santrifüj sırasında, 500 ul MACS tamponu ile bir mıknatıs yerleştirilen önceden soğutulmuş bir manyetik sütun dengeye. </li><li> (Hücre sayıları daha yüksek 1 x 10 8 bu hacim buna göre büyütmek) 500 ul MACS-tampon hücreleri yeniden süspanse ve kolona dikkatle hücreleri geçerlidir. Vδ1 içeren flow-through toplayın - hücrelerini. </li><li> 500 ul MACS tamponu ile sütun üç kez yıkayın ve aynı tüp içinde tekrar flow-through toplamak. Rezervuar kolona tampon uygulamadan önce boş olması gerektiğini unutmayın. </li><li> Manyetik cihazdan sütun çıkarın ve 15 ml konik tüp içine yerleştirin. Hızlı bir şekilde sıkı bir şekilde sütuna pistonu iterek 1 ml MACS tamponu ile kolonu temizlemek. Bir tüp içinde eluat toplayın. NOT:&gt;% 98 bir saflığa elde etmek için, genellikle tekrar için gerekli olan ikinci bir sütun ile) 2.7-2.9 adımları tekrarlayın. </li><li> (2.1.2 bakınız) eskisi gibi antikor paneli ile FACS analizi 18 ile hücrelerin saflığını doğrulayın ve hücreleri saymak. </li></ol> Vδ1CD4 + T hücrelerinin 3. İzolasyon <ol><li> &gt; 30 saniye boyunca bir vorteks CD4 boncuk 25 ul yeniden süspanse edin. 1 dakika boyunca mıknatıs tüp yerleştirilmesi ile, 1.5 ml reaksiyon tüpünde 1 ml MACS tamponu boncuk (üretici tarafından gösterildiği gibi az miktarda) yıkayın. Küçük ölçekli bir pipet (200 ul) ile dikkatlice süpernatant atın ve MACS-tampon orijinal hacminin boncuk tekrar süspansiyon. </li><li> 1 için Vδ1 + hücreleri (santrifüj topaklaşmasına2 dk; ve) 300 xg&#39;de süpernatant aspirat ve 500 ul MACS-tamponu tüm Vδ1 + hücreleri tekrar süspansiyon ve boncuk içeren tüp ekleyebilirsiniz. Kuvvetli bir şekilde karıştırın ve (bir rotatör içine örneğin) sabit bir eğimlenme 4 ° C&#39;de 20 dakika inkübe edilir. </li><li> 2 dakika için bir mıknatıs hücreleri ihtiva eden tüp yerleştirin. Kapaktaki hiçbir kalıntıları olmadığından emin olun. Not: CD4 + hücreleri manyetik taneler bağlanmış ve mıknatısın bakan tüp yan eklemek olacaktır. </li><li> Bir küçük ölçekli pipet kullanarak Vδ1 + hücreler - dikkatle manyetik cihazın içindeki tüpü tutarak kapağı açın ve CD4 içeren süpernatant toplamak. Ayrı bir tüp içine Vδ1 + hücreleri ve nüfus CD4 hücreleri veya boncuk kalan muhtemelen önlemek için tekrar cazibe merkezi haline bu tüp yerleştirmek - CD4 yerleştirin. <ol><li> CD4 yıkayın - hücreleri, 5 ml MACS tamponu içinde (santrifüj 12 dakika boyunca, 300 xg da) and 100 ul ortam başına 1 x 10 5 hücre konsantrasyonunda bunları tekrar süspansiyon. CD4 - hücreler hali hazırda (4.2) aşağıda belirtilen koşullar altında kültive edilebilir. </li></ol></li><li> , Manyetik alanın dışında CD4 + hücre hedefleri ile tüp koyun 500 ul MACS-tamponu hücrelerin tekrar süspansiyon ve manyetik cihazın içine geri koydu. Tekrarlayın daha yüksek bir saflık elde etmek için iki kez 3.3-3.5 adımları tekrarlayın. Pipetleme süpernatantı </li><li> 100 ul kültür ortamı CD4 + hücreleri (RPMI 1640,% 10 FCS,% 1 L-glutamin,% 1 Penisilin / Streptomisin) yeniden süspanse edin ve bir boncuk-ayırma çözeltisi 10 ul ekle. Sabit devirme (örneğin, bir rotatör içinde) ile birlikte 45 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 1 dakika süre ile bir mıknatıs hücreleri yerleştirin. Dikkatle küçük ölçekli bir pipet kullanarak boncuk ücretsiz Vδ1 + CD4 + hücreleri içeren süpernatant toplamak. </li><li> Mıknatıs dışında, 100 ul kültür ortamı ve tekrar ile boncuklar tekrar süspansiyonCD4 + hücrelerinin yüksek hücre sayıları elde etmek için iki kez 3.6 ve 3.7 adımları tekrarlayın. </li><li> Hücreleri pellet&#39;leştirilmesi (12 dakika boyunca, 300 xg&#39;de santrifüj) ve pipetleme tamamen süpernatant atın. Taze, önceden ısıtılmış medya hücrelerin tekrar süspansiyon ve onları saymak. 2.1.1-2.1.3 adımda tasvir, FACS analizi ile Vδ1 + CD4 + hücrelerinin saflığı inceleyin. </li></ol> Sınırlı seyreltme ile 4. Tek hücreli Klonlama <ol><li> 1.1-1.6 tasvir edildiği gibi, bir allojenik donor periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) izole edilir. </li><li> Γ-ışını kullanılan 25 ml kültür ortamı içinde 80 Gy ile 2.5 x 10 7 allojeneik PBMC&#39;ler ışın tedavisi. </li><li> , 96 oyuklu U-şekli plakalarında 5 x 10 4 besleyici bunları ışınlanmış besleyici hücreler IL-2 (200 U / ml), IL-7 (20 ng / ml) ve PHA (2 ug / ml) ilave edin ve dağıtma oyuk başına 50 ul hücre. </li><li> 50 ul başına 0,3 hücre konsantrasyonuna Vδ1 + CD4 + hücreleri ile seyreltilir. Pipette her bir oyuğa ışınlanmış hücreleri ve sitokinler barındıran hücre çözeltisi 50 ul. NOT: Bu nedenle, sitokinler 100 U / ml IL-2, 10 ng / ml IL-7 ve 1 ug / ml PHA nihai konsantrasyona kadar seyreltilir. 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 nemlendirilmiş atmosfer içinde, bir kuluçka makinesi içinde, 96 gözlü levhalar inkübe edin. <ol><li> İsteğe bağlı olarak, klonlar aynı kültür koşulları altında dökme kültürü olarak Vδ1 + CD4 + hücreleri üzerinde saflaştırılmıştır kalan geliştirin. </li></ol></li><li> Sitokinler ve taze medya ile her 3-4 günde hücre kaynağı. Bunun için, pipetleme ile 50 ul taze ortam ile kuyu ortamın değişimi yarısı. Her takviyesine sitokinlerin 2 kat konsantrasyon ekleyin. Beslenme de her tur başına 5x10 4 ışınlanmış besleyici hücreler ekleyin. </li><li> Kültür ortamı ve form kolonilerinin rengini değiştirmek böylece metabolize olarak, ilk klon 3-4 hafta sonra görünür hale gözlemlemek ve bir mikroskop kullanarak. NOT: kürk içinther ekimi, iyi klon tekrar süspansiyon ve bunları, 96 gözlü levhalar ayrı aktarın. 2.1.1-2.1.3 belirtildiği gibi FACS yoluyla hücreleri analiz edin. Bu şartlar altında tutulmuştur klonlar nihayetinde αβTCR için Vδ1 kendi TCR değişebilir. Bu transdiferansiyonun için zaman noktası klonlamak için klon değişir. </li></ol>

<ol>
	<li>Bhandoola, A., von, B. H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commitment+and+developmental+potential+of+extrathymic+and+intrathymic+T+cell+precursors:+plenty+to+choose+from.">Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from.</a> Immunity. 26 (6), 678-689 (2007).</li><li>Von, B. H., Melchers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checkpoints+in+lymphocyte+development+and+autoimmune+disease.">Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease.</a> Nat. Immunol. 11 (1), 14-20 (2010).</li><li>Prinz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+earliest+steps+of+gammadelta+T+cell+development+in+the+adult+thymus.">Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus.</a> Nat. Immunol. 7 (9), 995-1003 (2006).</li><li>Ferrero, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCRgamma+silencing+during+alphabeta+T+cell+development+depends+upon+pre-TCR-induced+proliferation.">TCRgamma silencing during alphabeta T cell development depends upon pre-TCR-induced proliferation.</a> J. Immunol. 177 (9), 6038-6043 (2006).</li><li>Krangel, M. S., Carabana, J., Abbarategui, I., Schlimgen, R., Hawwari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enforcing+order+within+a+complex+locus:+current+perspectives+on+the+control+of+V(D)J+recombination+at+the+murine+T-cell+receptor+alpha/delta+locus.">Enforcing order within a complex locus: current perspectives on the control of V(D)J recombination at the murine T-cell receptor alpha/delta locus.</a> Immunol. Rev. 200, 224-232 (2004).</li><li>Hawwari, A., Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+rearranged+variable+gene+segments+in+directing+secondary+T+cell+receptor+alpha+recombination.">Role for rearranged variable gene segments in directing secondary T cell receptor alpha recombination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (3), 903-907 (2007).</li><li>Hawwari, A., Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+TCR+delta+and+alpha+repertoires+by+local+and+long-distance+control+of+variable+gene+segment+chromatin+structure.">Regulation of TCR delta and alpha repertoires by local and long-distance control of variable gene segment chromatin structure.</a> J. Exp. Med. 202 (4), 467-472 (2005).</li><li>Hawwari, A., Bock, C., Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+T+cell+receptor+alpha+gene+assembly+by+a+complex+hierarchy+of+germline+Jalpha+promoters.">Regulation of T cell receptor alpha gene assembly by a complex hierarchy of germline Jalpha promoters.</a> Nat. Immunol. 6 (5), 481-489 (2005).</li><li>Hager, E., Hawwari, A., Matsuda, J. L., Krangel, M. S., Gapin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+constraints+at+the+level+of+TCRalpha+rearrangement+impact+Valpha14i+NKT+cell+development.">Multiple constraints at the level of TCRalpha rearrangement impact Valpha14i NKT cell development.</a> J. Immunol. 179 (4), 2228-2234 (2007).</li><li>Linton, P. J., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+lymphocyte+development+and+function.">Age-related changes in lymphocyte development and function.</a> Nat. Immunol. 5 (2), 133-139 (2004).</li><li>Sprent, J., Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+life-span+and+memory.">Lymphocyte life-span and memory.</a> Science. 265 (5177), 1395-1400 (1994).</li><li>Guy-Grand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+T+cell+lymphopoiesis:+ontogeny+and+contribution+to+gut+intraepithelial+lymphocytes+in+athymic+and+euthymic+mice.">Extrathymic T cell lymphopoiesis: ontogeny and contribution to gut intraepithelial lymphocytes in athymic and euthymic mice.</a> J. Exp. Med. 197 (3), 333-341 (2003).</li><li>McClory, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+stepwise+program+of+extrathymic+T+cell+development+within+the+human+tonsil.">Evidence for a stepwise program of extrathymic T cell development within the human tonsil.</a> J. Clin. Invest. 122 (4), 1403-1415 (2012).</li><li>Jbakhsh-Jones, S., Jerabek, L., Weissman, I. L., Strober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+maturation+of+alpha+beta+T+cells+from+hemopoietic+stem+cells.">Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells.</a> J. Immunol. 155 (7), 3338-3344 (1995).</li><li>Garcia-Ojeda, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+development+of+committed+progenitors+in+the+bone+marrow+that+generate+functional+T+cells+in+the+absence+of+the+thymus.">Stepwise development of committed progenitors in the bone marrow that generate functional T cells in the absence of the thymus.</a> J. Immunol. 175 (7), 4363-4373 (2005).</li><li>Arcangeli, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+hemopoietic+progenitors+committed+to+T+cell+differentiation+in+the+adult+mouse.">Extrathymic hemopoietic progenitors committed to T cell differentiation in the adult mouse.</a> J. Immunol. 174 (4), 1980-1988 (2005).</li><li>Maillard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-dependent+T-lineage+commitment+occurs+at+extrathymic+sites+following+bone+marrow+transplantation.">Notch-dependent T-lineage commitment occurs at extrathymic sites following bone marrow transplantation.</a> Blood. 107 (9), 3511-3519 (2006).</li><li>Ziegler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Peripheral+CD4(+)+Vdelta1(+)+gammadeltaT+Cells+Can+Develop+into+alphabetaT+Cells.">Human Peripheral CD4(+) Vdelta1(+) gammadeltaT Cells Can Develop into alphabetaT Cells.</a> Front Immunol. 5, 645 (2014).</li><li>Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+simulations+of+the+energy+dissipation+rate+in+a+fluorescence-activated+cell+sorter:+Implications+to+cells.">Computer simulations of the energy dissipation rate in a fluorescence-activated cell sorter: Implications to cells.</a> Biotechnol Bioeng. 100 (2), 260-272 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Pozitif manyetik hücre izolasyonu için Vδ1 ve CD4: kıt (T-) hücre varlığın fenotip, biyoloji ve işlevini incelemek için, yani Vδ1 + CD4 + T hücreleri, iki işaret kullanılır. CD4 monositler ve dendritik hücreler üzerinde daha düşük bir seviyede, T yardımcı hücreleri üzerinde ifade edilen ve hematopoietik progenitör hücreler üzerindeki çok düşük bir seviyede, oysa Vδ1, yetim reseptörüdür. Yüksek saflıkta hücrelerin zenginleştirilmesi ve seçim ...

Omurgalılarda, hücresel ve bağışıklığın bir hümoral bölümünde yapılandırılmıştır adaptif bağışıklık patojenlere karşı savunmasında önemli bir rol oynar. Antijenleri geniş bir tanıma, T hücreleri ile ilgili olarak timus 1 esas olarak üretilecek varsayılır hyperpolymorphic T ve B hücresi reseptörlerinin (TCR / BCR), aracılık eder. Bunun üzerine, kemik iliğinden elde edilen hematopoetik kök hücrelerin (HSC), timus tohum ve nihayet tüm T hücre soyları sebebiyet veren iyi tanımlanmış aşamaları boyunca ayırt. Ve CD8 - - Thymus ekim atalarıdır CD4 ve böylece olgunlaşmamış, çift negatif (DN) timosit kısmını oluşturmaktadır. Thymus türetilmiş sinyaller daha sonra soy bağlılığı ve αβ veya γδ T hücrelerinin içine ya farklılaşmasını teşvik. DN2 / 3 timositlerde fonksiyonel olarak yeniden düzenlenmiş TCR-γ ve TCR-δ zincir genlerinin sentezlenmesi selüler proliferasyon, bir sürücü δTCR kompleksleri, y olan yol açarγ ¨t hücrelerine 2,3 içine farklılaşmasını teşvik d. Buna karşılık, bir preTCR pT oluşturmak için preTα eşleştirmeden işlevsel TCR-β zincirinin yeniden düzenlenmesi, transkripsiyon DN3 timositlerde TCR-γ zincirinin susturulması ve CD4 + CD8 + çift pozitif timositleri 4 içine geçiş indükler . Bu aşamada, TCR-α zincirinin rekombinasyon ve böylece, bu hücrelerin geri dönülmez 5-9 üretim, bir γδTCR ortadan kaldıran, TCR-α lokusundaki sırtını TCR-δ lokusunu silme oluşur. Rearranged αβTCRs sonradan otoimmünitesini (negatif seçim) önlemek için belirli bir eşiği geçemez zayıf (pozitif seçimi) öz-MHC bağlanma yetenekleri için seçilir. MHC sınıf I veya II bağlama kapasitelerine göre, seçilen αβT hücreler tek-pozitif CD4 + veya CD8 + T hücreleri, timus çıkış naif T hücreleri dönüşür. Ancak, timus involusyonu erken neredeyse söndürülmüş sonrası ergenlik 10 naif T hücrelerinin katlanarak azaltılmış çıkış yol açan yaşam başlar. Bununla birlikte, T hücresi havuzunun büyüklüğü sonrası timik homeostatik T hücrelerinin çoğalması ve uzun ömürlü immünolojik bellek 11 proliferasyonu ile sadece kısmen açıklanabilir ömrü boyunca sabit kalır. Sonuç olarak, T-hücresi gelişimi extrathymic gerçekleşmelidir. Son zamanlarda yapılan araştırmalar-de extrathymic fonksiyonel αβ T hücrelerinin 12-17 yol siteleri-verdi αβT hücre atalarıdır, karakterize önemli cazibe kazanmıştır. Oysa, bir timus bağımsız αβT hücrelerine ayırt extrathymic αβT hücre öncüleri hakkında detaylı bilgi biz onlar böylece almak güzergahı üzerinde olan arka plan olarak bölük pörçük olduğunu. Biz son zamanlarda Vδ1 + küçük T-hücre varlık tespit </sup&gt; hafif inflamatuar ortamında αβT hücrelerine transdifferentiate sağlıklı insan vericilerden periferal kandan izole edilen bir extrathymic αβT hücre prognitor 18 olarak CD4 + γδT hücreleri. İlginç bir şekilde ve potansiyel olarak yeni antijenler kabul edilebilir, böylece bu şekilde, repertuarı genişleyen çeşitlilik sonrası timik T hücrelerinin proliferasyonu homeostatik, Vδ1 CD4 + hücrelerinin transdiferansiyonun yeni T hücre reseptörleri üreten, aksine ve koruma olabilir yeni alınan patojenlere karşı konakçı. Bu T hücrelerinin plastisite ekler ve extrathymic T hücre gelişimi için şimdiye kadar farkedilmemiş yeni yolu ekler. Amaç bu αβT hücresi extrathymic gelişimini precursor`s tetikleyen işaretleri ve molekülleri tanımlamak için lenfositik kaynaklardan niceliksel izolasyonu, tek hücre klonlarının oluşturulması ve etkin genişletme gereklidir.

<table><tbody><tr><td>Biocoll Solution</td><td>Biochrom</td><td>L 6113</td><td>lymphocyte separating solution</td></tr><tr><td>Lysing Buffer</td><td>BD BioSciences</td><td>555899</td><td>lysis of erythrocytes&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MACS buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>supplement with BSA and pre-cool before use</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>not mandatorily from this supplier</td></tr><tr><td>anti-human Vd1 FITC (clone:&amp;nbsp; TS8.2)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TCR2730</td><td>not mandatorily from this supplier</td></tr><tr><td>anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)</td><td>BD BioSciences</td><td>345766</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)</td><td>BD BioSciences</td><td>555548</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-333</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)</td><td>BD BioSciences</td><td>641400</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>Anti-FITC MultiSort Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-058-701</td><td>yields better results than anti-FITC MicroBeads</td></tr><tr><td>MS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>pre-cool before use</td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Positive Isolation Kit</td><td>life technologies</td><td>11331D</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and ex vivo culture of v&#948;1+cd4+&#947;&#948; t cells, an extrathymic &#945;&#946;t-cell progenitor

Timus, αβ T hücreleri ve omurgalılarda adaptif bağışıklık sisteminin omurgasının oluşturulması için primer organ uzun αβT hücrelerinin tek kaynak olarak kabul edilmiştir. Ancak, timik involüsyon çevresine naif αβT hücrelerinin büyük ölçüde azalır çıkış lider hayatında erken başlıyor. Yine de, hatta asırlık yeni alınan patojenlere karşı bağışıklık inşa edebilirsiniz. Son araştırmalar fonksiyonunun timus kaybını telafi edebilir yolların ancak bizim anlayış hala rudimental olan extrathymic αβT hücre gelişimini göstermektedir. γδ T hücreleri dokularda temel T-hücresi alt kümesi oluşturur doğuştan lenfositlerdir. Biz son zamanlarda göstererek bir γδ T hücre alt kümesine bir şimdiye kadar farkedilmemiş seçkin işlevi atfedilen o CD4 kıt varlık + Vδ1 + γδ T hücreleri inflamatuar koşullarda αβT hücrelerin içine transdifferentiate olabilir. Burada, biz pperiferik kandan bu dede izolasyonu ve sonraki ekimi için protokol rovide. Vδ1 hücreleri pozitif bir başka manyetik işaretleme tekniği ile CD4 + hücrelerinin az kısmını hedef olup, burada, bir ikinci aşamada, ardından manyetik boncuklar kullanılarak Sağlıklı insan donörlerden bir PBMC&#39;lerden zenginleştirilmiştir. İkinci etiketleme manyetik kuvvet ilk manyetik etiket biri aşıyor ve bu nedenle faiz nüfusunun, verimli nicel ve belirli olumlu izolasyonu sağlar. Daha sonra hücreler, klonlama ve verimli bir şekilde genişletilmesi için ve FACS analizi ile üretilmiştir klonlarının tespiti için gerekli olan teknik ve kültür durum getirmektedir. Böylece, saflaştırma, kültür ve CD4 + Vδ1 + γδ T hücrelerinin ex vivo artışı için detaylı bir protokol sağlar. Bu bilgi, bu αβT hücre progenitor`s biyoloji ile ilgili çalışmalara ve ide amaçlayan olanlar için ön koşuldurBunu transdiferansiyonun yer alan moleküler tetikler ntify.

Şekil 1, farklı aşamaları ve periferal kandan Vδ1 T hücrelerinin izolasyonu sonucunu göstermektedir. Şekil 1A, CD3 + lenfositler, Vδ1 + hücrelerinin tipik dağılımı, hem de Vδ1 + popülasyonunun ko-reseptör ifadesini gösterir. Bu donör olarak Vδ1 + hücreleri (kırmızı) sıklığı toplam lenfosit sayımları% 2.3 ve Vδ1 + lenfositlerin CD4 ifadesi (yeşil)% 2.6 olduğunu. Tamamen, izolasyon için hedef nüfusu ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Ex Vivo Culture of VÃŽÂ´1+CD4+ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells, an Extrathymic ÃŽÂ±ÃŽÂ²T-cell Progenitor at JoVE.com

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

İzolasyon ve<em&gt; Ex Vivo</emVδ1 of&gt; Kültür<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T hücrelerinin bir Extrathymic αβT hücre Progenitör

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

isolation-ex-vivo-culture-v1-cd4-t-cells-an-extrathymic-t-cell

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

9.3K Görüntüleme.  Children's University Hospital Tübingen. Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Video: Isolation and Ex Vivo Culture of Vδ1+CD4+γδ T Cells, an Extrathymic αβT-cell Progenitor

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Timus Karakterizasyonu kullanma Fare Embriyo atalarıdır Settling<em&gt; In Vivo</em&gt; Ve<em&gt; In Vitro</em&gt; Tahliller

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Gelişim Biyolojisi

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Multivirus-spesifik T hücrelerinin üretilmesi Allojenik Hematopoetik Kök Hücre Nakli sonra Viral Enfeksiyonlar önleme / tedavi etmek için

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

İzolasyon ve naif CD4 T Lenfositler Th17 Farklılaşma

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major histocompatibility complex (MHC)-independent manner and develop strong cytolytic effector function that makes it an ideal candidate for cancer immunotherapy. Due to the low frequency of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T cells in the peripheral blood, we developed an effective protocol to greatly expand a highly pure &#947;&#948; T cells drug product for first-in-human use of allogeneic &#947;&#948; T cells in patients with acute myeloid leukemia (AML). Using healthy donor apheresis as an allogenic cell source, the lymphocytes are isolated using a validated device for a counterflow centrifugation method of separating cells by size and density. 
The lymphocyte-rich fraction is utilized, and the &#947;&#948; T cells are preferentially activated with zoledronic acid (FDA-approved) and interleukin (IL)-2 for 7 days. Following the preferential expansion of &#947;&#948; T cells, a clinical-grade magnetic cell-separation device and TCR&#945;&#946; beads are used to deplete contaminating T-cell receptor (TCR)&#945;&#946; T cells. The highly enriched &#947;&#948; T cells then undergo a second expansion using engineered artificial antigen-presenting cells (aAPCs) derived from K562 cells-genetically engineered to express single-chain variable fragment (scFv) for CD3 and CD28, 41BBL (CD137L) and IL15-RA-together with zoledronic acid and IL-2. Seeding all day-7 enriched &#947;&#948; T cells in co-culture with the aAPCs facilitates the manufacture of highly pure &#947;&#948; T cells with an average fold expansion of &gt;229,000-fold from healthy donor blood.

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta &#947;&#948; T Cells from Apheresed Human Product

Presented is a protocol for the expansion of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T cell drug product. Lymphocytes are isolated by elutriation and &#947;&#948;-enriched with zoledronic acid and interleukin-2. Alpha-beta T cells are depleted using a clinical-grade magnetic separation device. The &#947;&#948; cells are co-cultured with K562-derived, artificial antigen-presenting cells and expanded.

Aferezli İnsan Ürününden Gama-Delta (φδ) T Hücrelerinin Genişlemesi ve Zenginleştirilmesi

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

Kanser Araştırmaları

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Fare Naif CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Hücre İzolasyonu ve<em&gt; In vitro</em&gt; T hücre alt içine Farklılaşma

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have been conducive to downstream in vivo functional analysis of TCR heterodimers. We have developed an improved protocol based on a two-step multiplex-nested PCR, which results in a PCR product that spans entire variable regions of a human TCR alpha and beta chains. By identifying unique restriction sites and incorporating them into the PCR primers, we have made the PCR product compatible with direct sub-cloning into the template retroviral vector. The resulting retroviral construct encodes a chimeric human/mouse TCR with a mouse intracellular domain, which is functional in mouse cells or in in vivo mouse models. Overall, the protocol described here combines human single cell paired TCR alpha and beta chain identification with streamlined generation of retroviral vectors readily adaptable for in vitro and in vivo TCR expression. The video and the accompanying material are designed to give a highly detailed description of the single cell PCR, so that the critical steps can be followed and potential pitfalls avoided. Additionally, we provide a detailed description of the cloning steps necessary to generate the expression vector. Once mastered, the whole procedure from single cell sorting to TCR expression could be performed in a short two-week period.

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

The current protocol combines single cell paired human TCR alpha and beta chain sequencing with streamlined generation of retroviral vectors compatible with in vitro and in vivo TCR expression.

Tek hücre TCR yalıtım ve üretme-in Vitro için Retroviral Vektörler ve In Vivo ifade insan TCRs aerodinamik

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high mortality, despite new therapeutic options such as transcatheter aortic valve replacement (TAVR). 
The complete pathways that start with valve calcification and lead to severe aortic stenosis remain only partly understood. By providing a close representation of the aortic valve cells in vivo, the assaying of T lymphocytes from stenotic valve tissue could be an efficient way to clarify their role in the development of calcification. After surgical excision, the fresh aortic valve sample is dissected in small pieces and the T lymphocytes are cultured, cloned then analyzed using fluorescence activated cell sorting (FACS).
The staining procedure is simple and the stained tubes can also be fixed using 0.5% of paraformaldehyde and analyzed up to 15 days later. The results generated from the staining panel can be used to track changes in T cell concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific T cell subtypes of interest. In this study, we show the isolation of T cells, performed on fresh calcified aortic valve samples and the steps of analyzing T cell clones using flow cytometry to further understand the role of adaptive immunity in CAVD pathophysiology.

In this study, we describe the process of T lymphocyte isolation from fresh samples of calcified aortic valves and the analytical steps of T cell-cloning for the characterization of the adaptive leukocyte subsets by using flow cytometry analysis.

Işınlanmış Buffy Coat'dan Besleyici Hücreler Kullanılarak T Lenfositlerin İzolasyonu ve Kültürü Yoluyla Aort Kapak Kireçlenmesinin Araştırılması

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

<meta charset="utf8"></head><body>T hücrelerinde Ca2+ mikro alanları tespit etmek için yüksek çözünürlüklü görüntüleme tekniği

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and might already determine the fate of a T cell. Upon T cell receptor activation, NAADP is formed rapidly, binding to NAADP binding proteins (HN1L/JPT2, LSM12) and their respective receptors (RyR1, TPC2) sitting on intracellular Ca2+ stores, like the ER and lysosomes, and leading to subsequent release and elevation of [Ca2+]i. To capture these fast and dynamically occurring Ca2+ signals, we developed a high-resolution imaging technique using a combination of two Ca2+ indicators, Fluo-4 AM and FuraRed AM. For postprocessing, an open-source, semi-automated Ca2+ microdomain detection approach was developed based on the programming language Python. Using this workflow, we are able to reliably detect Ca2+ microdomains on a subcellular level in primary murine and human T cells in high temporal and spatial resolution fluorescence videos. This method can also be applied to other cell types, like NK cells and murine neuronal cell lines.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spot Işığı: Terapötik Müdahale için Adaptif Bağışıklık Tepkisinin İlk Aktivasyonunun Çözülmesi

Here, we provide a comprehensive protocol to resolve initial local Ca2+ signals, known as Ca2+ microdomains, in primary murine and human T cells using fluorescence microscopy. This protocol serves as a valuable resource for researchers examining Ca2+ signaling pathways within immune cells and to further unravel their function.

Primer T Hücrelerinde İlk Ca2+ Mikro Alanlarının Görüntülenmesi

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

İzolasyon ve

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Timus Karakterizasyonu kullanma Fare Embriyo atalarıdır Settling

Multivirus-spesifik T hücrelerinin üretilmesi Allojenik Hematopoetik Kök Hücre Nakli sonra Viral Enfeksiyonlar önleme / tedavi etmek için

İzolasyon ve naif CD4 T Lenfositler Th17 Farklılaşma

Aferezli İnsan Ürününden Gama-Delta (φδ) T Hücrelerinin Genişlemesi ve Zenginleştirilmesi

Fare Naif CD4

Tek hücre TCR yalıtım ve üretme-in Vitro için Retroviral Vektörler ve In Vivo ifade insan TCRs aerodinamik

Işınlanmış Buffy Coat'dan Besleyici Hücreler Kullanılarak T Lenfositlerin İzolasyonu ve Kültürü Yoluyla Aort Kapak Kireçlenmesinin Araştırılması

Primer T Hücrelerinde İlk Ca²⁺ Mikro Alanlarının Görüntülenmesi

Primer T Hücrelerinde İlk Ca²⁺ Mikro Alanlarının Görüntülenmesi

Primer T Hücrelerinde İlk Ca²⁺ Mikro Alanlarının Görüntülenmesi