Name: isolation and ex vivo culture of vδ1+cd4+γδ t cells, an extrathymic αβt-cell progenitor
Uploaded: 2015-12-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Ex Vivo Culture of VÃŽÂ´1+CD4+ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells, an Extrathymic ÃŽÂ±ÃŽÂ²T-cell Progenitor at JoVE.com

Christian Welker is funded by a grant provided by the J&#252;rgen-Manchot-Stiftung.

윤리 문 : 모든 절차는 헬싱키 선언에 따라 수행하고, 튀빙겐 대학의 임상 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 (38 / 2009B02 470 / 2013B02 프로젝트). 말초 혈액 단핵 세포의 1. 분리 (PBMC를) <ol><li> 1,000 IU의 헤파린 황산을 포함하는 50 ML의 주사기를 사용하여 정맥 천자를 통해 건강한 지원자에서 50 ~ 100 mL를 취하여 혈액 1 희석 : PBS (PH = 7.2)과 (2). </li><li> 15 ml의 혈액 분리 솔루션에 PBS 용액 등 Biocoll로 (D = 1.077 ㎍ / ㎖) 50 ㎖에 원뿔 튜브 : 조심스럽게 혈액 35 ml의 레이어. 실온에서 800 XG에 15 분 동안 원심 분리기. 참고 : 브레이크는 사용할 수 없습니다. </li><li> 피펫 림프 층의 세포를 수집하고, 적어도 50 ml의 PBS로 두 번 세포를 씻어 (400 XG에서 12 분간 원심 분리). 피펫과 원심 분리 한 후 상층 액을 제거합니다. </li><li> 를 Lyse는 일시 중지 및 incub에 의해 적혈구 남아2-4 분간 저장성 완충액 1-5 mL를 림프 분획 ating. 주 : 노광, 용균 완충액의 양 기간이 사용될 용균 버퍼와 림프구 분획에 남아 적혈구의 양에 의존한다. </li><li> 12 분 동안 250 XG에서 PBS (1시 10분)와 세포와 원심 분리기를 희석하고, 이후에 재현 탁하고 12 분 동안 300 XG에 10 ml의 PBS에 한 번 세포 펠렛을 씻는다. </li><li> PBS에서 림프구를 재현 탁하고 트리 판 블루에게 솔루션을 사용 노이 바 우어 계산 실에서 세포를 계산합니다. 참고 : 일반적으로,&gt; 1 × 8 림프구가 100 ㎖에서받은 갓 말초 혈액을 그려. </li></ol> Vδ1 T 세포의 격리 2. <ol><li> Vδ1 CD4 T 세포의 빈도를 결정하는 초기 FACS를위한 &lt;1 × 106 림프구 절연 걸릴. 참고 :이 T 세포 개체의 인구 크기는 개인과 자신의 면역 상태에 따라 따라 크게 다를 수 있습니다. Typic아군, T 세포의 약 1 % 및 Vδ1 Vδ1 + + 세포의 1~5 %의 시간 CD4 +이다. <ol><li> PBS가 2 % FCS, 5 mM의 EDTA를 함유하는 1 ml의 이루어져의 FACS 완충액으로 세포를 희석. 2 분 동안 660 XG에 원심 분리기 및 뜨는을 가만히 따르다. 약 100 ㎕의 FACS 완충액 환류 량은 후속 염색 충분하다. 간단히 소용돌이 5 μL는 FACS 염색의 증가 특이성을 실온에서 5 분 동안 시약 된 Fc-차단과 세포를 품어. </li><li> 은 FC-차단 시약을 제거하지 않고 세포에 직접 인간 단일 클론 항체를 추가합니다. , CD8 (1 : 200)와 TCRαβ (1시 25분) : Vδ1 (1시 50분), CD3 (1시 50분), CD4 (200 1)에 대한 항체와 세포를 염색해야합니다. 해당 면역 글로불린 아이소 타입과 이소 제어를 준비합니다. 어둠 속에서 4 ° C에서 20 분 동안 항체와 세포를 품어. </li><li> (2 분 동안 원심 분리, 660 XG에) 1 ML의 외과 버퍼에 세포를 씻으, supern을 가만히 따르다atant 나머지 버퍼 볼륨 외과 인수를 진행합니다. </li></ol></li><li> 12 분 동안 원심 분리하여 (FACS 분석에 사용되지 않는다) 세포를 펠릿 화; 300g에; 8 ° C. 상층 액을 제거하고 1 × 10 7 세포 당 60 μL의 맥 버퍼 pelletin 셀을 재현 탁. 1 × 10 7 세포 당 20 μL 된 Fc-차단 시약을 추가하고 4 ℃에서 5 분 동안 품어. </li><li> 직접 세포에 1 × 10 7 세포 당 10 μL FITC - 복합 항 - 인간 Vδ1 항체를 추가합니다. 어둠 속에서 4 ° C에서 12 분 동안 품어. </li><li> 14 ml의 맥 버퍼를 사용하여 세포를 세척 (12 분 동안 원심 분리기를 300 g에서 8 ° C)를. 완전히 뜨는을 취소하고 1 × 7 세포 당 80 μL의 맥 버퍼에있는 세포를 재현 탁. </li><li> 1-2 × 10 5 세포를 가지고 FACS 분석하여 라벨의 확인을 위해 100 μL FACS 버퍼를 희석. 더 이상의 첨가제는이 단계에서 필요하지 않습니다. suffi이 있는지 확인Vδ1의 밝기 효율적인 차이 - 그리고 Vδ1 + 세포. 그렇지 않은 경우, 반복) 2.3) 2.4 단계. </li><li> 나머지 셀에 1 × 10 7 세포 당 20 μl를 방지 FITC 마이크로 비드를 추가, 잘 ​​섞는다 4 ° C에서 어둠 속에서 15 분 동안 품어. 그 후, (300 XG에서 12 분 동안 원심 분리기 8 ° C)를 최소 10 ml의 맥 버퍼를 사용하여 세포를 씻으십시오. </li><li> 원심 분리 동안, 500 μL의 맥 버퍼와 자석에 배치 미리 냉각 자기 열 평형. </li><li> (세포 수보다 높은 1 × 8이 볼륨 따라 규모를 확대) 500 μL의 MACS-버퍼에 세포를 재현 탁하고 컬럼에 조심스럽게 세포를 적용합니다. Vδ1 함유 관류 수집 - 셀. </li><li> 500 μL의 맥 버퍼로 열 세 번 세척하고 같은 튜브에 다시 흐름을 통해 수집합니다. 저수지 컬럼에 버퍼를 적용하기 전에 비어 있어야합니다. </li><li> 자기 장치에서 열을 제거하고 15 ML 원뿔 튜브에 배치합니다. 빨리 단단히 열에 플런저를 밀어 1 ml의 맥 버퍼와 컬럼을 세척하십시오. 튜브에 용출액을 수집합니다. 주 :&gt; 98 %의 순도를 얻기 위해, 그것은 일반적으로 반복 할 필요가 초 컬럼) 2.7부터 2.9까지 단계. </li><li> (2.1.2 참조) 이전과 같은 항체 패널 FACS 분석 (18)에 의해 세포의 순도를 확인하고 세포를 카운트. </li></ol> Vδ1CD4 + T 세포의 3. 분리 <ol><li> &gt; 30 초 동안 소용돌이와 CD4 비즈의 25 μl를 재현 탁. 1 분 동안 자석에 튜브를 배치하여 1.5 ml의 반응 튜브에 1 ㎖의 MACS 완충액 비드 (제조자에 의해 도시 된 바와 같이 최소한의 양)을 세척한다. 작은 규모의 피펫 (200 μL) 조심스럽게 뜨는을 취소하고 맥 버퍼의 원래 볼륨에서 구슬을 재현 탁. </li><li> 1 Vδ1 + 세포 (원심 분리기를 펠릿2 분; 등) 300 XG에서하면 뜨는을 대기음 500 μL의 맥 버퍼의 모든 Vδ1 + 세포를 재현 탁하고 구슬이 들어있는 튜브에 추가합니다. 적극적으로 믹스 (회 전자에서, 예를 들어) 일정한 경사와 4 ° C에서 20 분 동안 품어. </li><li> 2 분 동안 자석에 세포를 포함하는 튜브를 놓는다. 뚜껑에는 잔해가 없는지 확인합니다. 주 : CD4 + 세포는 자성 비드를 결합하고 자석에 대향 관의 측면에 부착 한 것이다. </li><li> 소규모 피펫을 사용하여 Vδ1가 + 세포를 - 조심스럽게 자기 장치 내부에 튜브를 유지하면서 뚜껑을 열고 CD4이 포함 된 상층 액을 수집합니다. 별도의 튜브에 Vδ1가 + 세포 인구에서 CD4 세포 또는 구슬 남아 가능성 피하기 위해 다시 자석으로이 관을 배치 - CD4를 놓습니다. <ol><li> CD4 워시 - 세포를 5 ml의 맥 - 버퍼 (원심 분리기 12 분 동안 300 XG에)ND 100 μL 용지 당 1 × 105 세포의 농도로 재현 탁 그들을. CD4 - 세포 용이 (4.2) 아래에 주어진 조건에서 재배 할 수있다. </li></ol></li><li> , 외부 자계의 CD4 + 세포 표적과 관을 배치 500 μL의 MACS 완충액에 세포를 재현 탁하고, 자기 장치에 다시 넣어. 반복은 더 높은 순도를 얻기 위해 두 번 3.3-3.5 단계를 반복합니다. 피펫으로 상층 액을 제거 </li><li> 100 μL 문화 미디어에서 CD4 + 세포 (RPMI 1640, 10 % FCS, 1 % L 글루타민, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신)를 재현 탁하고 비드 분리 용액 10 μl를 추가합니다. 일정한 경사 (예를 들면, 회전)에 45 분 동안 RT에서 배양한다. </li><li> 1 분 동안 자석에서 세포를 놓습니다. 신중 소규모 피펫을 사용하여 비드없는 Vδ1 + CD4 + 세포를 포함하는 상층 액을 모은다. </li><li> 자석의 외부, 100 μL 문화 미디어와 반복과 구슬을 재현 탁CD4 + 세포의 높은 세포 수를 얻기 위해 두 번 3.6 및 3.7 단계를 반복합니다. </li><li> 세포를 펠릿 화 (12 분, 300 XG에 원심 분리기)와 피펫 팅에 의해 완전히 상층 액을 버린다. 신선한, 미리 예열 미디어 세포를 재현 탁하고이를 계산합니다. 2.1.1-2.1.3 단계에 묘사 된 FACS 분석에 의해 Vδ1 + CD4 + 세포의 순도를 검사합니다. </li></ol> 제한 희석 4. 단일 세포 복제 <ol><li> 1.1-1.6에 도시 된 바와 같이, 동종 기증자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 분리. </li><li> γ 방사선을 사용하여 25 ml의 배양 배지에서 80 Gy를 2.5 × 10 7 동종 PBMC를 조사. </li><li> 96- 웰 U 형 플레이트에 5 × 104 공급기들을 조사 피더 세포에 IL-2 (200 U / ㎖), IL-7 (20 NG / ㎖) 및 PHA (2 μg의 / ㎖)를 첨가하고, 분산 물론 당 50 μL 세포. </li><li> 50 μL 당 0.3 세포의 농도로 Vδ1 + CD4 + 세포를 희석. 피펫TE 각 웰 조사 세포 및 사이토 카인에 형질 세포 용액 50 μL. 주 : 따라서, 사이토 카인을 100 U / ㎖의 IL-2, 10 NG / ml의 IL-7 및 1 μg의 / ㎖의 PHA의 최종 농도로 희석된다. 37 ° C, 5 % CO 2 분위기에서 가습 인큐베이터에서 96 웰 플레이트를 배양한다. <ol><li> 선택적으로, 클론과 동일한 배양 조건에서 대량으로 배양 Vδ1 + CD4 + 세포를 정제하고 남은 배양. </li></ol></li><li> 사이토 카인과 신선한 미디어 3-4 일마다 세포를 제공합니다. 이를 위해, 50 μL 피펫 신선한 배지로 웰에 배지 교환 절반. 모든 보충에 사이토 카인의 2 배 농도를 추가합니다. 수유 아니라 다른 모든 라운드 당 5 × 4 조사 피더 세포를 추가합니다. </li><li> 배지 및 콜로니 형태의 색상을 변경할 따라서 그들은 대사로서, 제 클론 3-4 주 후 가시가 관찰하고, 현미경 사용. 참고 : 모피를 들어THER 재배, 잘 클론을 재현 탁하고 96 웰 플레이트를 분리 전송합니다. 2.1.1-2.1.3에서 나타낸 바와 같이 FACS를 통해 세포를 분석한다. 이러한 조건에서 유지 클론은 결국 αβTCR에 Vδ1에서 자신의 TCR을 변경할 수 있습니다. 이 분화에 대한 시점은 복제하는 복제에 따라 다릅니다. </li></ol>

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	<li>Bhandoola, A., von, B. H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commitment+and+developmental+potential+of+extrathymic+and+intrathymic+T+cell+precursors:+plenty+to+choose+from.">Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from.</a> Immunity. 26 (6), 678-689 (2007).</li><li>Von, B. H., Melchers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checkpoints+in+lymphocyte+development+and+autoimmune+disease.">Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease.</a> Nat. Immunol. 11 (1), 14-20 (2010).</li><li>Prinz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+earliest+steps+of+gammadelta+T+cell+development+in+the+adult+thymus.">Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus.</a> Nat. Immunol. 7 (9), 995-1003 (2006).</li><li>Ferrero, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCRgamma+silencing+during+alphabeta+T+cell+development+depends+upon+pre-TCR-induced+proliferation.">TCRgamma silencing during alphabeta T cell development depends upon pre-TCR-induced proliferation.</a> J. Immunol. 177 (9), 6038-6043 (2006).</li><li>Krangel, M. S., Carabana, J., Abbarategui, I., Schlimgen, R., Hawwari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enforcing+order+within+a+complex+locus:+current+perspectives+on+the+control+of+V(D)J+recombination+at+the+murine+T-cell+receptor+alpha/delta+locus.">Enforcing order within a complex locus: current perspectives on the control of V(D)J recombination at the murine T-cell receptor alpha/delta locus.</a> Immunol. Rev. 200, 224-232 (2004).</li><li>Hawwari, A., Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+rearranged+variable+gene+segments+in+directing+secondary+T+cell+receptor+alpha+recombination.">Role for rearranged variable gene segments in directing secondary T cell receptor alpha recombination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (3), 903-907 (2007).</li><li>Hawwari, A., Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+TCR+delta+and+alpha+repertoires+by+local+and+long-distance+control+of+variable+gene+segment+chromatin+structure.">Regulation of TCR delta and alpha repertoires by local and long-distance control of variable gene segment chromatin structure.</a> J. Exp. Med. 202 (4), 467-472 (2005).</li><li>Hawwari, A., Bock, C., Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+T+cell+receptor+alpha+gene+assembly+by+a+complex+hierarchy+of+germline+Jalpha+promoters.">Regulation of T cell receptor alpha gene assembly by a complex hierarchy of germline Jalpha promoters.</a> Nat. Immunol. 6 (5), 481-489 (2005).</li><li>Hager, E., Hawwari, A., Matsuda, J. L., Krangel, M. S., Gapin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+constraints+at+the+level+of+TCRalpha+rearrangement+impact+Valpha14i+NKT+cell+development.">Multiple constraints at the level of TCRalpha rearrangement impact Valpha14i NKT cell development.</a> J. Immunol. 179 (4), 2228-2234 (2007).</li><li>Linton, P. J., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+lymphocyte+development+and+function.">Age-related changes in lymphocyte development and function.</a> Nat. Immunol. 5 (2), 133-139 (2004).</li><li>Sprent, J., Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+life-span+and+memory.">Lymphocyte life-span and memory.</a> Science. 265 (5177), 1395-1400 (1994).</li><li>Guy-Grand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+T+cell+lymphopoiesis:+ontogeny+and+contribution+to+gut+intraepithelial+lymphocytes+in+athymic+and+euthymic+mice.">Extrathymic T cell lymphopoiesis: ontogeny and contribution to gut intraepithelial lymphocytes in athymic and euthymic mice.</a> J. Exp. Med. 197 (3), 333-341 (2003).</li><li>McClory, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+stepwise+program+of+extrathymic+T+cell+development+within+the+human+tonsil.">Evidence for a stepwise program of extrathymic T cell development within the human tonsil.</a> J. Clin. Invest. 122 (4), 1403-1415 (2012).</li><li>Jbakhsh-Jones, S., Jerabek, L., Weissman, I. L., Strober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+maturation+of+alpha+beta+T+cells+from+hemopoietic+stem+cells.">Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells.</a> J. Immunol. 155 (7), 3338-3344 (1995).</li><li>Garcia-Ojeda, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+development+of+committed+progenitors+in+the+bone+marrow+that+generate+functional+T+cells+in+the+absence+of+the+thymus.">Stepwise development of committed progenitors in the bone marrow that generate functional T cells in the absence of the thymus.</a> J. Immunol. 175 (7), 4363-4373 (2005).</li><li>Arcangeli, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+hemopoietic+progenitors+committed+to+T+cell+differentiation+in+the+adult+mouse.">Extrathymic hemopoietic progenitors committed to T cell differentiation in the adult mouse.</a> J. Immunol. 174 (4), 1980-1988 (2005).</li><li>Maillard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-dependent+T-lineage+commitment+occurs+at+extrathymic+sites+following+bone+marrow+transplantation.">Notch-dependent T-lineage commitment occurs at extrathymic sites following bone marrow transplantation.</a> Blood. 107 (9), 3511-3519 (2006).</li><li>Ziegler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Peripheral+CD4(+)+Vdelta1(+)+gammadeltaT+Cells+Can+Develop+into+alphabetaT+Cells.">Human Peripheral CD4(+) Vdelta1(+) gammadeltaT Cells Can Develop into alphabetaT Cells.</a> Front Immunol. 5, 645 (2014).</li><li>Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+simulations+of+the+energy+dissipation+rate+in+a+fluorescence-activated+cell+sorter:+Implications+to+cells.">Computer simulations of the energy dissipation rate in a fluorescence-activated cell sorter: Implications to cells.</a> Biotechnol Bioeng. 100 (2), 260-272 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

긍정적 자기 세포 분리를 위해 Vδ1 및 CD4 : 부족한 (T-) 세포의 표현형 엔티티, 생물학 및 기능을 연구하기 위해, 즉 Vδ1 + CD4 + T 세포, 우리는 두 개의 마커를 사용 하였다. CD4가 단핵 세포 및 수상 세포에 낮은 레벨, T 헬퍼 세포에 발현 한 조혈 전구 세포에 매우 낮은 레벨에있는 반면 Vδ1는 고아 수용체이다. 고순도 세포 농축하고 선택하기위한 기술은 형광 세?...

척추 동물에서 세포 및 면역의 체액 부분으로 구성되어 적응 면역은 병원체에 대한 방어에 중요한 역할을한다. 항원의 광범위한 인식은 T 세포와 관련하여 흉선 1에서 주로 생성되는 것으로 가정 hyperpolymorphic B 및 T- 세포 수용체 (TCR / BCR)에 의해 매개된다. 이에는 골수로부터 유도 된 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포)는, 흉선 시드 최종적 모든 T 세포 계통을 발생주고 잘 정의 된 스테이지를 따라 차별화. 및 CD8 - - 흉선 시드 조상은 CD4이며, 따라서 미성숙, 더블 네거티브 (DN) 흉선 세포의 일부를 구성한다. 흉선에서 유래 신호는 자신의 계보 헌신과 αβ 또는 γδ T 세포 중 하나에 분화를 유도. DN2 / 3 흉선 세포에 기능적으로 재 배열 된 TCR-γ 및 TCR-δ 사슬 유전자의 발현은 세포 증식의 드라이브 δTCR 단지를, γ에 이르게γ의 ΔT 세포 2,3로 분화를 촉진 거라고. 대조적으로, preTCR하여, Pt를 구축 preTα 페어링 수 기능적 TCR-β 사슬의 재 배열은, 전사 DN3의 흉선 세포의 TCR-γ 사슬의 사일런 및 CD4 + CD8 + 이중 양성 흉선 세포 (4)에 그들의 전이를 유도 . 이 단계에서, TCR-α 사슬의 재조합은 따라서 이들 세포 돌이킬 5-9 생산 γδTCR를 폐지, TCR-α 궤적 내에 멈춰서 TCR-δ 궤적 삭제를 발생한다. 재 배열 αβTCRs 이후자가 면역 (부정적인 선택)를 방지하기 위해 특정 임계 값을 초과 할 수 없습니다 약하게 (긍정적 인 선택을) 자기 MHC를 결합 할 수있는 능력, 선택됩니다. MHC 클래스 I 또는 II를 결합 그들의 능력에 따라, 선택된 셀 αβT은 단일 양성 CD4 + 또는 CD8 + T 세포, 흉선 출구로서 나이브 T 세포로 발달. 그러나, 흉선의 퇴화 일찍 거의 소멸 후 사춘기 10 나이브 T 세포의 기하 급수적으로 감소 출력에 최고의 인생에서 시작됩니다. 그럼에도 불구하고, T 세포 풀의 크기는 포스트 흉선 항상성 T 세포의 증식 및 수명이 긴 면역 메모리 (11)의 확산에 의해 부분적으로 만 설명 될 수 수명 내내 일정하게 유지된다. 따라서 extrathymic T 세포 발달이 발생한다. 최근의 연구-에서 extrathymic 기능 αβ T 세포 12-17을 초래 사이트 - 준 αβT 세포 전구 세포를 특징으로 상당한 매력을 얻고있다. 그러나, 흉선 독립적가 αβT 세포로 분화 extrathymic αβT 세포 전구체에 대한 자세한 지식은 우리가 그들이하여 수행 경로에있는 배경으로 단편이다. 우리는 최근 Vδ1 +의 작은 T 세포 개체를 식별 </suP&gt; 가벼운 염증 환경에서 αβT 세포에 transdifferentiate 수있는 건강한 인간 기증자의 말초 혈액에서 분리 extrathymic αβT 세포 prognitor (18), 같은 CD4 + γδT 세포. 흥미롭게 잠재적 새로운 항원을 인식 할 수 있도록, 따라서 레퍼토리의 다양성을 확대 후 흉선 T 세포의 항상성 증식 Vδ1 CD4 + 세포의 분화 새로운 T 세포 수용체를 생성하고, 반대로 보호 수도 새롭게 취득한 병원체에 대해 숙주. 이는 T 세포의 가소성에 가산 extrathymic T 세포 개발 원경 인정받지 새로운 경로를 추가한다. 대물이 αβT 셀 extrathymic 개발 precursor`s ​​트리거 이들 마커 분자를 식별하기위한 소스로부터 림프 정량적 격리는 단일 세포 클론의 발생 및 그 효율적인 확장이 필수적이다.

<table><tbody><tr><td>Biocoll Solution</td><td>Biochrom</td><td>L 6113</td><td>lymphocyte separating solution</td></tr><tr><td>Lysing Buffer</td><td>BD BioSciences</td><td>555899</td><td>lysis of erythrocytes&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MACS buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>supplement with BSA and pre-cool before use</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>not mandatorily from this supplier</td></tr><tr><td>anti-human Vd1 FITC (clone:&amp;nbsp; TS8.2)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TCR2730</td><td>not mandatorily from this supplier</td></tr><tr><td>anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)</td><td>BD BioSciences</td><td>345766</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)</td><td>BD BioSciences</td><td>555548</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-333</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)</td><td>BD BioSciences</td><td>641400</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>Anti-FITC MultiSort Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-058-701</td><td>yields better results than anti-FITC MicroBeads</td></tr><tr><td>MS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>pre-cool before use</td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Positive Isolation Kit</td><td>life technologies</td><td>11331D</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and ex vivo culture of v&#948;1+cd4+&#947;&#948; t cells, an extrathymic &#945;&#946;t-cell progenitor

흉선, αβ T 세포와 척추 동물에서 적응 면역계의 주쇄의 생성을위한 주요 기관은, 긴 αβT 세포의 공급원으로서 만 고려되고있다. 그러나, 흉선 퇴화는 주변에 순진 αβT 세포의 대폭 감소 출력에 이르는 인생의 초기에 시작됩니다. 그럼에도 불구하고, 심지어 백세인은 새로 인수 한 병원균에 대한 면역을 구축 할 수 있습니다. 최근의 연구 기능의 흉선 손실을 보상 할 수있다 경로의 그러나 우리의 이해는 여전히 rudimental 있으며, extrathymic αβT 전지 개발을 제안합니다. γδ ​​T 세포는 주 조직에서 T 세포 서브 세트를 구성 타고난 림프구이다. 우리는 최근 보여 γδ T 세포의 서브 세트에 지금까지 뛰어난 기능을 인정받지 기인하는 CD4의 부족한 엔티티 Vδ1 + + γδ T 세포가 염증 상태의 세포 내로 αβT transdifferentiate있다. 여기, 우리 쪽말초 혈로부터이 선조의 분리 및 그 후속 재배 프로토콜 rovide. Vδ1 세포 양 우리가 상기 자성 라벨링 기술에 CD4 + 세포의 부족 부분을 대상으로 상기 제 2 단계이어서, 자성 비드를 이용하여 건강한 인간 공여자로부터의 PBMCs를 충실. 제 라벨링의 자력은 제 1 자기 라벨의 하나 초과하고, 따라서 관심 인구의 효율적인 양적 및 특정 양의 절연을 허용한다. 우리는 그 다음 세포를 복제하고 효율적으로 확장과 FACS 분석에 의해 생성 된 클론의 식별을 위해 필요한 기술과 문화 조건을 소개합니다. 따라서, 우리는 정제, 문화와 CD4 + Vδ1 + γδ T 세포의 생체 확장에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 지식이 αβT 세포 progenitor`s ​​생물학 관련 연구 및 IDE하는 것을 목표로 사람들을위한 전제 조건입니다그 분화에 관여하는 분자 트리거를 ntify.

도 1은 다른 단계 및 말초 혈액으로부터 Vδ1 T 세포의 분리의 결과를 도시한다.도 1a는 CD3 + 림프구 Vδ1 + 세포의 전형적인 분포뿐만 아니라 Vδ1 + 인구의 공 수용체의 발현을 나타낸다. 이 도너에서 Vδ1 + 세포 (적색)의 주파수는 총 림프구 수가 2.3 %이고 Vδ1 + 림프구의 CD4 발현 (녹색) 2.6 %이다. 요컨대, 분리를위한 표적 집단이 도너의 ...

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Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

분리 및<em&gt; 전의 VIVO</emVδ1의&gt; 문화<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T 세포, Extrathymic αβT 세포 선조

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

isolation-ex-vivo-culture-v1-cd4-t-cells-an-extrathymic-t-cell

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

9.2K 조회수.  Children's University Hospital Tübingen. Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

비디오: Isolation and Ex Vivo Culture of Vδ1+CD4+γδ T Cells, an Extrathymic αβT-cell Progenitor

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 체외</em&gt; 분석 실험

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

연구

발생학

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Multivirus 특정 T 세포 생성 Allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 바이러스 감염을 예방 / 치료

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

면역학 및 감염병학

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major histocompatibility complex (MHC)-independent manner and develop strong cytolytic effector function that makes it an ideal candidate for cancer immunotherapy. Due to the low frequency of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T cells in the peripheral blood, we developed an effective protocol to greatly expand a highly pure &#947;&#948; T cells drug product for first-in-human use of allogeneic &#947;&#948; T cells in patients with acute myeloid leukemia (AML). Using healthy donor apheresis as an allogenic cell source, the lymphocytes are isolated using a validated device for a counterflow centrifugation method of separating cells by size and density. 
The lymphocyte-rich fraction is utilized, and the &#947;&#948; T cells are preferentially activated with zoledronic acid (FDA-approved) and interleukin (IL)-2 for 7 days. Following the preferential expansion of &#947;&#948; T cells, a clinical-grade magnetic cell-separation device and TCR&#945;&#946; beads are used to deplete contaminating T-cell receptor (TCR)&#945;&#946; T cells. The highly enriched &#947;&#948; T cells then undergo a second expansion using engineered artificial antigen-presenting cells (aAPCs) derived from K562 cells-genetically engineered to express single-chain variable fragment (scFv) for CD3 and CD28, 41BBL (CD137L) and IL15-RA-together with zoledronic acid and IL-2. Seeding all day-7 enriched &#947;&#948; T cells in co-culture with the aAPCs facilitates the manufacture of highly pure &#947;&#948; T cells with an average fold expansion of &gt;229,000-fold from healthy donor blood.

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta &#947;&#948; T Cells from Apheresed Human Product

Presented is a protocol for the expansion of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T cell drug product. Lymphocytes are isolated by elutriation and &#947;&#948;-enriched with zoledronic acid and interleukin-2. Alpha-beta T cells are depleted using a clinical-grade magnetic separation device. The &#947;&#948; cells are co-cultured with K562-derived, artificial antigen-presenting cells and expanded.

감마 델타(γδ) T 세포의 확장 및 농축

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

암 연구학

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have been conducive to downstream in vivo functional analysis of TCR heterodimers. We have developed an improved protocol based on a two-step multiplex-nested PCR, which results in a PCR product that spans entire variable regions of a human TCR alpha and beta chains. By identifying unique restriction sites and incorporating them into the PCR primers, we have made the PCR product compatible with direct sub-cloning into the template retroviral vector. The resulting retroviral construct encodes a chimeric human/mouse TCR with a mouse intracellular domain, which is functional in mouse cells or in in vivo mouse models. Overall, the protocol described here combines human single cell paired TCR alpha and beta chain identification with streamlined generation of retroviral vectors readily adaptable for in vitro and in vivo TCR expression. The video and the accompanying material are designed to give a highly detailed description of the single cell PCR, so that the critical steps can be followed and potential pitfalls avoided. Additionally, we provide a detailed description of the cloning steps necessary to generate the expression vector. Once mastered, the whole procedure from single cell sorting to TCR expression could be performed in a short two-week period.

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

The current protocol combines single cell paired human TCR alpha and beta chain sequencing with streamlined generation of retroviral vectors compatible with in vitro and in vivo TCR expression.

단일 셀 TCR 고립과 Retroviral 벡터 생체 외에서 의 생성과 Vivo에서 표현의 인간의 TCRs 간소화

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high mortality, despite new therapeutic options such as transcatheter aortic valve replacement (TAVR). 
The complete pathways that start with valve calcification and lead to severe aortic stenosis remain only partly understood. By providing a close representation of the aortic valve cells in vivo, the assaying of T lymphocytes from stenotic valve tissue could be an efficient way to clarify their role in the development of calcification. After surgical excision, the fresh aortic valve sample is dissected in small pieces and the T lymphocytes are cultured, cloned then analyzed using fluorescence activated cell sorting (FACS).
The staining procedure is simple and the stained tubes can also be fixed using 0.5% of paraformaldehyde and analyzed up to 15 days later. The results generated from the staining panel can be used to track changes in T cell concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific T cell subtypes of interest. In this study, we show the isolation of T cells, performed on fresh calcified aortic valve samples and the steps of analyzing T cell clones using flow cytometry to further understand the role of adaptive immunity in CAVD pathophysiology.

In this study, we describe the process of T lymphocyte isolation from fresh samples of calcified aortic valves and the analytical steps of T cell-cloning for the characterization of the adaptive leukocyte subsets by using flow cytometry analysis.

조사 된 버피 코트에서 피더 세포를 사용하여 T 림프구의 격리 및 배양을 통해 대동맥 밸브 석회화 조사

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

<meta charset="utf8"></head><body>T 세포에서 Ca2+ 마이크로도메인을 검출하기 위한 고분해능 이미징 기법

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and might already determine the fate of a T cell. Upon T cell receptor activation, NAADP is formed rapidly, binding to NAADP binding proteins (HN1L/JPT2, LSM12) and their respective receptors (RyR1, TPC2) sitting on intracellular Ca2+ stores, like the ER and lysosomes, and leading to subsequent release and elevation of [Ca2+]i. To capture these fast and dynamically occurring Ca2+ signals, we developed a high-resolution imaging technique using a combination of two Ca2+ indicators, Fluo-4 AM and FuraRed AM. For postprocessing, an open-source, semi-automated Ca2+ microdomain detection approach was developed based on the programming language Python. Using this workflow, we are able to reliably detect Ca2+ microdomains on a subcellular level in primary murine and human T cells in high temporal and spatial resolution fluorescence videos. This method can also be applied to other cell types, like NK cells and murine neuronal cell lines.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Unraveling the Initial Activation of the Adaptive Immune Response for Therapeutic Intervention

Here, we provide a comprehensive protocol to resolve initial local Ca2+ signals, known as Ca2+ microdomains, in primary murine and human T cells using fluorescence microscopy. This protocol serves as a valuable resource for researchers examining Ca2+ signaling pathways within immune cells and to further unravel their function.

일차 T 세포에서 초기 Ca2+ 마이크로도메인 이미징

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

분리 및

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흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착

Multivirus 특정 T 세포 생성 Allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 바이러스 감염을 예방 / 치료

분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

감마 델타(γδ) T 세포의 확장 및 농축

마우스 나이브 CD4

단일 셀 TCR 고립과 Retroviral 벡터 생체 외에서 의 생성과 Vivo에서 표현의 인간의 TCRs 간소화

조사 된 버피 코트에서 피더 세포를 사용하여 T 림프구의 격리 및 배양을 통해 대동맥 밸브 석회화 조사

일차 T 세포에서 초기 Ca²⁺ 마이크로도메인 이미징

일차 T 세포에서 초기 Ca²⁺ 마이크로도메인 이미징

일차 T 세포에서 초기 Ca²⁺ 마이크로도메인 이미징